[发明专利]一种利用重组大肠杆菌生产1,4-丁二胺的方法

说明书

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌生产1,4‑丁二胺的方法，属于基因工程技术，利用高拷贝质粒pXMJ19，将精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶成功表达，构建得到重组菌。全细胞转化结果表明，原始菌不具有过量积累1,4‑丁二胺的能力，而重组菌可以实现过量积累1,4‑丁二胺；同时基于此基因工程菌株可过量积累1,4‑丁二胺的特性，成功采用酶法转化以精氨酸为底物生产1,4‑丁二胺。在细胞培养过程中添加IPTG诱导酶的表达，根据精氨酸脱羧酶酶学性质在转化体系中添加镁离子和辅酶磷酸吡哆醛。最终24h转化可以积累72.6g·L^‑1 1,4‑丁二胺，中间产物胍基丁胺产量为0.14g/L。

技术领域

本发明涉及一种利用重组大肠杆菌生产1,4-丁二胺的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

1,4-丁二胺(也称1,4-二氨基丁烷或腐胺)属于氨基酸衍生物，作为聚合物，药物，农用化学品，表面活性剂和其他添加剂的组分，具有许多工业应用。1,4-丁二胺目前用于通过与己二酸的缩聚反应合成尼龙-4,6。尼龙-4,6因其高熔点、高结晶度、高耐热性和高机械强度以及出色的耐溶剂性而成为一种优异的工程塑料，在纺织、机械化工、电子电器、汽车制造等领域都有着广泛的应用。因此，1,4-丁二胺具有十分广阔的市场应用前景。

工业规模上1,4-丁二胺的生产主要依赖于琥珀腈加氢的化学合成，琥珀腈通过在丙烯腈中添加氰化氢产生。化学路线需要不可再生的石油化工产品作为原材料和相对苛刻的反应条件，以及昂贵的催化剂。由于反应物具有剧毒和易燃性，因此从环境和人类健康的角度来看，化学合成路线并不可取。生物法生产1,4-丁二胺具有以下优点：环境友好且安全性高、产物可持续生产、利用低价值底物，降低生产成本等。因此，越来越需要开发一条从价格低廉、绿色环保、可再生的原料出发，生产1,4-丁二胺的生物技术方法，用于解决目前工业规模生产过程存在的问题。

生物酶法转化生产1,4-丁二胺有两种路径：1、利用精氨酸脱羧酶与胍丁胺酶串联表达将精氨酸转化为1,4-丁二胺；2、利用鸟氨酸脱羧酶将鸟氨酸转化为1,4-丁二胺。与化学合成法相比，利用酶法转化生产1,4-丁二胺具有步骤简单、副产物少以及绿色环保等优势，相比于鸟氨酸，以精氨酸为底物，价格更加低廉，成本更加便宜。但是目前采用精氨酸为底物，合成1,4-丁二胺，存在产量低等缺点，例如：Yu Deng等人研究公开的方法中，是采用通过过表达精氨酸脱羧酶和胍丁胺酶并结合良好控制的发酵策略的技术方案，但是生成的1,4-丁二胺的产量仅为26.21g·L^-1，并且存在产率低、转化周期长(至少48小时)等缺点(公开于“Highly efficient whole-cell biosynthesis of putrescine by recombinantEscherichia coli”论文当中)。

因此，如何采用精氨酸为底物，高效、且节约成本的合成1,4-丁二胺成为研究的热点和难点。

发明内容

技术问题：

本发明要解决的技术问题是：提供一种精氨酸脱羧酶突变体，及提供一种表达了精氨酸脱羧酶突变体和胍丁胺酶的重组大肠杆菌及其应用，并且提供了一种产率高、周期短、成本低的制备1,4-丁二胺的方法。

技术方案：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种精氨酸脱羧酶突变体，所述精氨酸脱羧酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶的第533位突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶的第533位由丙氨酸突变成脯氨酸得到的，命名为A533P。

在本发明的一种实施方式中，所述精氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了编码上述精氨酸脱羧酶突变体的基因。