[发明专利]一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB1；所述的引物序列如下：

外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；

外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；

内引物FIP的序列为：

CCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；

内引物BIP的序列为：

ATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；

环引物LB1的序列为：GTGTTATGGTATACGTCCTTGGAT。

2.一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB2；所述的引物序列如下：

外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；

外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；

内引物FIP的序列为：

CCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；

内引物BIP的序列为：

ATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；

环引物LB2的序列为：AAGTGTTATGGTATACGTCCTTGGA。

3.一种用于非洲马瘟LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及一条环引物LB3；所述的引物序列如下：

外引物F3的序列为：CCTCAAGGTGCGTCACTTG；

外引物B3的序列为：AGCGTTGGAGCCAATTCC；

内引物FIP的序列为：

CCATGCGACGACATCTCCAGCTGCTCCAGGAACTTTTGTCA；

内引物BIP的序列为：

ATCCTGGGGCACGCAGATCAGGAACCGTGTCTAGCGATC；

环引物LB3的序列为：AGTGTTATGGTATACGTCCTTGGAT。

4.一种用于非洲马瘟LAMP检测的扩增反应液，其特征在于，所述反应液为权利要求1-3任意一项中所述的用于非洲马瘟LAMP检测的引物。

5.如权利要求4所述的用于非洲马瘟LAMP检测的扩增反应液，其特征在于，所述反应液还包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl₂、Betaine、Tris-HCl、KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Triton X-100以及Bst DNA聚合酶。

6.一种用于非洲马瘟LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有洗涤液的离心管、含有裂解液的离心管、含有阴性对照溶液的离心管、含有阳性对照溶液的离心管以及八级联排检测管，所述检测管上设有测样孔，每一个所述测样孔内设置扩增反应液、核酸染料和稳定液，所述阴性对照溶液为无非洲马瘟病毒基因非传染DNA片段溶液，所述阳性对照溶液为含有非洲马瘟病毒基因非传染DNA片段溶液，所述扩增反应液为权利要求4-5任意一项所述的扩增反应液。

7.如权利要求6所述的用于非洲马瘟LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为4％的NaOH溶液。

8.如权利要求6所述的用于非洲马瘟LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述核酸染料为GeneFinder、SYBR Green、GelRed中的任意一种。

9.如权利要求6所述的用于非洲马瘟LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述稳定液为石蜡油。

10.一种应用权利要求6-9中任意一项所述的用于非洲马瘟LAMP检测的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、样本处理：取一定量的组织样本，将洗涤液加入组织样本中，充分混匀，室温静置充分液化，再对液化后的组织样本进行离心，收集沉淀；

S2、核酸提取：用裂解液重悬步骤S1中收集的沉淀，混匀，100℃温浴裂解5min～15min后，立即置于冰上，然后离心，保留上清液，上清液即为包含样本模板RNA的溶液，再利用反转录试剂盒进行逆转录，获得cDNA的样本溶液；

S3、加样反应：取若干检测管并分别标记阴性对照管、阳性对照管以及若干样本检测管，依次将阴性对照溶液、阳性对照溶液以及步骤S2中的cDNA样本溶液分别加入阴性对照管、阳性对照管和样本测样管中，后将检测管置于60℃～65℃条件下保温30min～60min，最后使所述检测管中的扩增反应液、核酸染料、稳定液与阴性对照溶液、阳性对照溶液或样本溶液充分混匀并离心，使充分反应的溶液分别聚集于各所述检测管的底部；

S4、结果判读。