[发明专利]副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和重组副溶血性弧菌减毒活疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种副溶血性弧菌基因缺失弱毒株以及以此为基础的疫苗。本发明所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株为不含有tdhA、vcrD1和vcrD2基因且外膜上高效表达lptD蛋白的菌株。本发明所述的疫苗为含有副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和药学上可以接受的稀释液，所述的疫苗的含量为每头份含菌株浓度为10⁸CFU，所述的稀释液为过0.22μm滤膜的PBS缓冲液或过0.22μm滤膜的生理盐水。本发明构建的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株的安全性实验表明，该菌株的毒力显著降低，对实验动物无毒性；而该菌株的免疫保护性分析表明其具有高效的免疫保护作用，可以100％保护实验动物免于死亡。

技术领域

本发明涉及一种副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和重组副溶血性弧菌减毒活疫苗及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

弧菌的革兰氏染色结果呈阴性，是一种嗜盐细菌，广泛存在于靠近河流以及海水的地区。由病原弧菌感染所引起的鱼、虾、贝类等的弧菌病是水产养殖动物最主要的细菌性疾病。目前，已发现有27种弧菌可引起弧菌病，其中以副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)最为常。副溶血性弧菌给人和各种生物带来了潜在的危害，其不仅危害水产养殖业的健康发展，使鱼虾感染细菌性疾病而死亡，造成巨大经济损失，同时也是我国主要的食源性致病菌。当前对弧菌病的预防和治疗主要是投喂抗生素，但这种方出现了一定的缺陷，出现了药物的残留和菌体产生相应的抗药性两大问题，这已成为影响危害人们身体健康和食品安全，从而也导致了水产的一些作物出现了劣质和损失。

外膜蛋白(outermembraneprotein)主要由革兰氏阴性菌产生，位于细菌肽聚糖层的外部，是组成其细菌细胞壁的一种成分，是构成细菌外膜的一种重要结构，其在细菌中的含量很高，可达其胞质外结构全部组成的二分之一。作为外膜的主要组分，外膜蛋白在细菌的生命活动中起着重要作用，细菌正常形态的维持以及物质的合成、细菌的抗药性等都离不开它。某些病原菌外膜蛋白具有粘附素作用,有助于病原菌对宿主细胞的粘附；某些病原菌外膜蛋白还具有抗吞噬、抗补体及抗血清杀菌等作用，有助于病原菌逃避宿主的免疫防御，从而达到致病目的。因为外膜蛋白是细菌的最外侧的结构，所以在细菌侵袭宿主细胞时，各种不同的外膜蛋白可以与宿主细胞的表面蛋白或受体发生相互作用，介导病原菌对宿主细胞的感染，但同时，外膜蛋白也是最容易容易被宿主的免疫系统所识别并被免疫系统认作是抗原的一类蛋白，所以有些外膜蛋白可以诱导宿主产生具有高度保护性的免疫应答。因此，对于宿主来说，病原菌的外膜蛋白可能是具有重要保护作用的抗原，并且一些外膜蛋白在同属不同种病原菌中高度保守，甚至一些蛋白在不同属的细菌中也存在一定的保守性，在不同种或同种不同血清型菌株诱发的免疫应答中可产生一定程度的交叉保护作用，因此，细菌的外膜蛋白也是最具潜力的疫苗靶点之一。目前，已有较多关于弧菌外膜蛋白的免疫原性的研究表明许多外膜蛋白具有良好的免疫原性，这些蛋白包括如OmpW,OmpV,OmpU,OmpK,PsuA, PvuA,VPA1435,VP0764,VPA1186,VP1061，VP2850等。先前的研究通过免疫蛋白质组学技术也发现lptD, LamB,OmpA,OmpK,OmpU,VP0802,VP1243以及VP0966等具有免疫原性。这些研究结果表明，外膜蛋白能够有效的刺激机体产生特异性抗体。此外，还有研究表明，某些外膜蛋白还可对相应病原菌的感染具有50-100％的免疫保护率，有些外膜蛋白还能够显著增强机体吞噬细胞的吞噬活性。

OMPs是在革兰氏阴性细菌中运输脂多糖的一系列具有特殊功能蛋白质。它不仅是革兰氏阴性细菌外膜的主要组分之一，脂多糖在细菌感染机体时也会发挥重要的作用。其结构以及功能已经被进一步的阐明，其致病机理也已经得到了充分的解释。近年发现，革兰氏阴性菌的脂多糖的跨膜转运以及在外膜上的组装是由一系列的转运蛋白LptA-G蛋白质复合物共同作用完成的。而存在于细菌膜上的跨膜蛋白lptD在另一个转运蛋白LptE的作用下，将脂多糖转运至细菌外膜，形成细菌外膜重要结构。有研究证实在封闭了lptD 的作用后，细菌的生长收到了很大程度的抑制，因此，lptD膜蛋白被认为是革兰氏阴性细菌存活的“命门”。因而lptD对细菌的生理功能和毒力均具有关键作用。目前，lptD蛋白的三维结构已经得到解析(图1)。