[发明专利]一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法

说明书

本发明涉及一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法，通过本发明，本发明构建携带腺苷酸环化酶的重组质粒pS‑DacA，将该质粒引入猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120，形成重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS‑DacA)。当DacA在猪霍乱沙门氏菌裂解载体中表达时，则催化ATP形成c‑di‑AMP。口服给药后，重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体rSC0120(pS‑DacA)进入宿主免疫细胞，释放c‑di‑AMP，激活宿主STING通路达到广谱抗病毒的效果。重组菌株rSC0120(pS‑DacA)被证实可以在巨噬细胞和小鼠体内激活STING通路，引起巨噬细胞和小鼠的抗病毒状态，抵抗PRRSV和PRV的攻击。该重组菌株具备广谱抗病毒的效力，适用于临床上各种动物病毒的防治。

技术领域

本发明涉及一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法，属于重组菌株技术领域。

背景技术

STING(干扰素基因刺激因子，stimulator of interferon genes)是目前药物研发的一个非常热门的靶点。STING激动剂是指可以与STING蛋白结合并激活其下游天然免疫应答的化合物，这类化合物通常为两分子的核苷酸或腺苷酸聚合物，例如：c-di-GMP，c-di-AMP等。近年来，STING激动剂在抗肿瘤领域的应用颇为广泛。Emily P等人的研究表明，人和小鼠STING激动剂ADU-S100减轻了携带胰腺导管腺癌(PDA)的小鼠的局部和远端肿瘤负担。尽管STING激动剂在肿瘤治疗领域被广泛研究，但关于STING激动剂在抗病毒领域的研究及应用却很少见。Tina M.Sali等人利用人工合成的STING激动剂G10在人细胞中引起抗病毒状态，使细胞抵抗甲病毒的攻击，该研究表明STING激动剂在抗感染领域具备一定的应用和开发潜力。

目前，STING激动剂的给药方式依赖佐剂或者基因枪的加持，这与STING蛋白的特性有关。STING蛋白是一种胞内蛋白，在体外施用STING激动剂时，须使STING激动剂与细胞内的STING蛋白结合才能使激动剂发挥作用。这就需要借助佐剂或基因枪等介质将STING激动剂运送至细胞内，如此才能使两者结合，从而诱导后续的药物反应。目前常用于递送STING激动剂的方法是阳离子佐剂包裹递送或基因枪注射。而这两种方法均存在明显的缺陷。就阳离子佐剂来说，该佐剂通常为高分子的纳米材料。这种材料很难在机体内被代谢排出，且有一定的细胞毒性，增加了给药风险。使用阳离子佐剂呈递STING激动剂时会对机体细胞造成损伤。就基因枪来说，基因枪注射技术门槛高，给药成本高。与STING激动剂结合时，推广应用性差。特别是在兽药领域，高昂的成本几乎难以被市场接受。此外，利用阳离子佐剂或者基因枪都难以靶向天然免疫细胞，这些STING激动剂大多数被运输至注射部位或者给药部位，而STING蛋白主要存在于树突细胞和巨噬细胞这两种天然免疫细胞中，上述两种给药方式无法靶向这两种天然免疫细胞。这使得STING激动剂的效果大打折扣。因此开发一种廉价高效的递送STING激动剂的新技术对于其应用，尤其自兽医领域的推广具有重要意义。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有问题，要解决的技术问题为：STING蛋白主要存在于树突细胞和巨噬细胞这两种天然免疫细胞中，而沙门氏菌的靶细胞正是树突细胞和巨噬细胞。因此，利用沙门氏菌呈递STING激动剂也许能够将STING靶向运输至这两种天然免疫细胞中，使得STING激动剂与天然免疫细胞中的STING蛋白充分结合，从而充分激活下游STING通路，提高药物利用率。此外，一般情况下，重组细菌载体中的有效成分难以穿越细菌细胞壁释放到宿主细胞内发挥作用。而本发明中所用于递送STING激动剂的猪霍乱沙门氏菌裂解载体具备程序性的裂解功能。本发明拟通过沙门氏菌对免疫细胞的强侵袭能力，程序性裂解的功能，将STING激动剂在沙门氏菌中表达，并通过裂解释放到宿主细胞质中，与宿主细胞内的STING蛋白结合，激活STING通路，诱导抗病毒天然免疫应答。STING激动剂在肿瘤治疗领域被广泛研究，而关于通过减毒裂解特性的沙门氏菌靶向递送STING激动剂在抗病毒领域的研究及应用却很少见。本发明利用重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体递送STING激动剂，并评价重组猪霍乱沙门氏菌裂解载体在猪巨噬细胞和小鼠中的抗病毒效力。