[发明专利]基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法和应用，主要涉及基因工程技术领域。所述系统包括：能够高效表达T7RNA聚合酶的哺乳动物细胞系、包含T7启动子及以EV71为例的RNA病毒全基因组cDNA感染性克隆，所用载体与表达T7RNA聚合酶的细胞高效匹配。相较于基于体外转录的RNA病毒拯救系统，本发明能够简单、高效地拯救出感染性正链RNA病毒，以EV71为例，所产生病毒能够连续传代，与亲本病毒具有一致的生物学特性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法和应用。

背景技术

T7 RNA聚合酶(T7pol)，是一种高度特异性识别T7启动子序列的DNA依赖的5′→3′RNA聚合酶。由于T7pol启动转录效率较强且具有严格的启动子识别特异性，所以基于T7pol的病毒拯救系统应用非常广泛。

肠道病毒EV71(Enterovirus 71，EV71)为非包膜的正链RNA病毒，是小RNA病毒(Picornaviridae)家族中肠病毒属成员。该病毒感染主要引起婴幼儿手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)，还可能导致神经系统并发症，甚至死亡。EV71病毒基因组全长约为7.4kb，可作为mRNA编码一个小的上游蛋白和一个大的多聚蛋白。而多聚蛋白最终会被加工形成四个结构蛋白(VP1-VP4)和七个非结构病毒蛋白(2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D)。尽管2015年EV71灭活病毒疫苗已获得中国许可。但截至目前，针对EV71病毒的特效药物仍未被发现，关于EV71病毒的致病机制仍需科研人员进行更深入的研究。

病毒基因组的遗传操作和感染性病毒的拯救能够给研究者带来诸多便利。因此近十年来，国内外有多个实验室曾对EV71 cDNA感染性克隆进行构建。但通常在完成病毒cDNA克隆的构建后，病毒的拯救还需要对cDNA进行线性化，并进一步在体外用RNA聚合酶转录，然后将纯化的高质量RNA转染到细胞中，才可能获得具有感染性的病毒。这些步骤不仅较为繁琐，还存在多种限制因素，导致病毒拯救不容易成功。如感染性克隆的线性化需要匹配合适的酶切位点，并且通常需要大量的感染性克隆质粒，而长链基因组感染性克隆的构建常常会使得质粒的拷贝数降低，从而影响高浓度的感染性克隆质粒的获取。除此之外，线性化后的cDNA进行体外转录所获得的RNA完整性也是影响拯救病毒实验成功的关键因素。

发明内容

针对目前的正链RNA病毒拯救系统在构建及病毒拯救的过程中存在的缺陷和问题，本发明的目的在于提供了一种以EV71肠道病毒作为模型，基于T7RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统及其构建方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于T7 RNA聚合酶的正链RNA病毒快速拯救系统，包括：能够表达T7 RNA聚合酶(T7pol)的哺乳动物细胞系、包含T7启动子及有正链RNA病毒核酸序列的感染性克隆；

所述感染性克隆在病毒核酸序列的5'端上游含T7启动子；

所述正链RNA病毒包括但不限于EV71肠道病毒。

优选的，其中所述哺乳动物细胞系为慢病毒整合介导表达T7pol的HEK293FT/T7pol细胞系，或通过转染含T7pol基因表达质粒的HEK293FT细胞。

优选的，其中所述感染性克隆的质粒骨架为pcDNA3.1+，且所述pcDNA3.1+的结构中不含有CMV启动子。

优选的，其中所述哺乳动物细胞系为整合慢病毒载体并介导T7 RNA聚合酶T7pol表达的细胞系、或瞬时转染含T7 RNA聚合酶T7pol基因质粒后表达T7 RNA聚合酶T7pol的细胞系。