[发明专利]一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统、方法、编辑后的巨噬细胞和应用

说明书

本发明涉及一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统、方法、编辑后的巨噬细胞和应用，属于抗肿瘤技术领域。本发明所述巨噬细胞的CRISPR/Cas9表观编辑系统包括以下组分：PCP‑EZH2、sgRNA‑X‑PP7和dCas9；所述PCP‑EZH2为PCP基因和EZH2基因的融合基因；所述sgRNA‑X‑PP7为用于插入sgRNA的含PP7适配子茎环的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述编辑系统能够从多方面增强巨噬细胞的抗肿瘤效应，促进T细胞等免疫应答，抑制肿瘤生长，显著改善肿瘤的治疗效果。

技术领域

本发明涉及抗肿瘤技术领域，具体涉及一种巨噬细胞的CRISPR/Cas9 表观编辑系统、方法、编辑后的巨噬细胞和应用。

背景技术

肿瘤是危害人类健康的重要危险因素之一。其发病率仅次于心脑血管疾病，位居第二位。然而传统的放疗、化疗及靶向药物等治疗方式都很难做到完全抑制肿瘤的作用。近年来，肿瘤免疫治疗受到越来越广泛的关注。免疫治疗是与以往的传统治疗完全不同的一类全新肿瘤治疗模式，其主要机制是改变肿瘤微环境，从而使机体自身的免疫功能重新发挥作用，达到杀伤肿瘤细胞的目的。正常机体的免疫系统具有免疫监视功能，即能够识别、杀伤并及时清除体内包括肿瘤细胞在内的异常增生细胞。随着肿瘤的进展，多种免疫细胞可以参与抑制抗肿瘤免疫，从而促进肿瘤的生长、侵袭和转移。

肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-Associated Macrophages，TAMs)是肿瘤免疫微环境中所占比例最多的免疫细胞，参与了肿瘤的生成、增殖、转移和耐药等多种生物学行为。长久以来研究认为巨噬细胞的发育来源是成年之后的造血系统，即骨髓中的HSC和外周血中的单核前体细胞。随着遗传修饰小鼠的应用，研究发现了定植于组织中的成熟巨噬细胞，随着个体的发育，巨噬细胞分别来源于三种不同的途径(来自卵黄囊和胎肝中的红细胞祖细胞(Erythro-myeloid progenitor，EMP)，以及来自骨髓中的巨噬细胞/树突细胞祖细胞(macrophage/dendritic cell progenitor cells，MDP)。在肿瘤发展过程中，TAMs可能来源于胚胎或单核细胞来源的组织定植巨噬细胞，这些巨噬细胞可能在癌发生过程中发生表型和活化状态的变化(组织驻留TAMs)，或来自经历明显分化的单核细胞，最终成为促进肿瘤生长的巨噬细胞。

机体组织中的巨噬细胞具有表型可变和功能多样的重要特征，在不同的环境刺激下，巨噬细胞可极化成具有不同分子表型和功能的两个亚型：M1 型(经典活化型)和M2型(替代活化型)。M1巨噬细胞由IFNγ及其他促炎刺激因素诱导，其表型特点为白介素(interleukin,IL)12，IL-23，IL-10 等。M1型的主要功能是有效呈递抗原，特异性表达一氧化氮合成酶2 (NOS2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6等标记分子。除此之外，M1型巨噬细胞可激活Th1反应，并且通常介导抗肿瘤反应。相反，M2型巨噬细胞由IL-10，糖皮质激素，IL-4和IL-13等因素诱导，其特异性表达精氨酸酶1(ARG1)、血管内皮生长因子(VEGF)、甘露糖受体(CD206)和TGF β等标记分子，这些表型参与受损组织的重塑和修复，寄生虫抗性，免疫调节和促肿瘤增殖。对于TAMs而言，肿瘤微环境中影响其极化的主要因素有三种：1)免疫相关信号是TAMs极化的关键决定因素；这些包括通过免疫细胞以及肿瘤和基质细胞本身在肿瘤部位释放的细胞因子，趋化因子和其他调节分子。值得注意的是，干细胞也可以是这些信号的来源(例如，通过神经胶质瘤干细胞释放POSTN)。2)代谢信号如乳酸(有氧糖酵解的副产物)也可以调控TAM影响肿瘤的发生发展。3)在自发(对于免疫原性肿瘤)或治疗诱发的肿瘤细胞死亡时释放的死亡信号可以激活TAMs，可以介导其促炎功能。