[发明专利]检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测结核分支杆菌的引物对、探针、试剂盒，所述试剂盒包含针对SEQID NO：1所示结核分支杆菌IS6110基因序列或其部分序列设计的引物对和探针。本发明的检测结核分支杆菌的试剂盒，基于巢式RPA检测技术(nestRPA)，最低可检出1拷贝/uL的结核分支杆菌核酸片段，具有超高灵敏度，且无需昂贵检测设备，检测时间短，最短仅需15分钟，该技术有利于早期发现感染结核分支杆菌人群，为感染结核分支杆菌人群的早期隔离和早期治疗提供新的技术支撑，具有非常好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基于巢式RPA(nestRPA)技术检测结核分支杆菌IS6110基因的引物对、探针、试剂盒及其应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部结核感染最为常见。排菌者为其重要的传染源。人体感染结核菌后不一定发病，当抵抗力降低或细胞介导的变态反应增高时，才可能引起临床发病。若能及时诊断，并给予合理治疗，大多可获临床痊愈。

结核菌属于放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，为有致病力的耐酸菌。主要分为人、牛、鸟、鼠等型。对人有致病性的主要是人型菌，牛型菌少有感染。1882年，德国细菌学家郭霍(Robert Koch，1843-1910)首先发现并证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。

结核病临床特征为：有较密切的结核病接触史，起病可急可缓，多为低热(午后为著)、盗汗、乏力、纳差、消瘦、女性月经失调等；呼吸道症状有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸闷或呼吸困难。结核分枝杆菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。

结核病严重影响人类健康和生命，人类与之斗争了许多世纪。在17-18世纪的欧洲，结核病被称为白色瘟疫，几乎100％的欧洲人被感染，25％的欧洲人死亡。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。

20世纪90年代以来，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。结核病成为首要的再现传染病，成为了全球尤其是发展中国家最为严重的全球性卫生问题。

全世界约有1/3的人感染结核分枝杆菌，每年有900万的新病例出现，有200万人死于该疾病。中国是结核病高负担国家，发病率仅次于印度。国内带菌人群多，发病人群多，死亡人群多。2018年，我国肺结核发病人数88.9万人，死亡人数3149人。2019年，我国肺结核的发病人数为96.31万人，死亡人数为2008人。

目前临床诊断方法一般为：痰涂片、结核菌素试验、特异性抗体测定(酶联吸附试验)、胸腔积液检查及影像学检查，结核菌聚合酶联反应(PCR)阳性有辅助诊断价值。

目前临床分子诊断技术主要分为：蛋白检测和核酸检测，例如：LAM抗原检测、Xpert qPCR核酸扩增法、核酸扩增和杂交、LAMP-PCR核酸扩增法。这些方法都具有各自的优缺点。其中，这些技术应用于结核分枝杆菌的检测时，仍然存在因灵敏度偏低，而造成结果假阴性的问题。此外，临床发现有30％左右的患者没有痰液或痰液很少，无法使用痰培养分离结核菌技术进行临床诊断；同时，即使有痰液的患者可以进行痰培养，其中仍有很大比例痰培养为阴性结果，而且痰培养的时间太长。因此，痰培养无法做到快速准确地诊断结核病。