[发明专利]一种鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针及其应用

说明书

本发明公开了一种鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针及其应用，属于疫病检测技术领域。所述探针的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，经FAM标记的探针可用于检测鲤浮肿病毒，也可以用于制备鲤浮肿病毒检测试剂盒。所述的探针与组织切片中的CEV P4a基因特异性杂交结合，所以较常规的染色检测更为灵敏、精准，还可根据样本切片分析CEV感染的阳性率和感染部位及程度。

技术领域：

本发明涉及分子生物学及水产养殖业水生动物疫病检测技术领域，具体涉及一种鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针及其应用。

背景技术：

鲤浮肿病(Carp edema virus disease，CEVD)，也称锦鲤昏睡病(koi sleepydisease,KSD)，是由一种痘病毒鲤浮肿病毒(Carp edema virus，CEV)感染鲤、锦鲤引起的高度传染性流行病。患病鱼常出现烂鳃、凹眼、昏睡等症状，疾病导致的死亡率高达80-100％，给水产养殖业造成严重经济损失。该病已在全球迅速蔓延，我国在2016年首次报道发生CEVD，是我国水生动物的一种新发疫病。

目前对CEV引起的鲤浮肿病尚无有效的治疗方法，只能以预防为主。因此建立准确、快速的现地检测方法，是有效防控CEVD的保障。由于CEV尚无易感细胞系，其检测方法主要依赖于套式PCR、荧光PCR等分子生物学方法。PCR检测虽然简单，灵敏度高，但不能直观的观察和证明CEV，而且易于因操作中的模板污染而出现假阳性。原位杂交假阳性率低，从而直观性、准确性和灵敏性综合考虑是一种其他任何方法都无法替代的检测方法，但至今未见有CEV的原位杂交检测方法。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是，提供一种鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针及其应用，根据鲤浮肿病毒编码P4a蛋白的保守序列设计合成3条DNA探针，可用于鲤浮肿病毒的原位杂交检测，具有优异的直观性、准确度和灵敏度。

本发明根据CEV P4a基因序列设计3条DNA探针，以FAM进行标记，制备鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针。

鲤浮肿病毒的原位杂交检测探针，其特征在于，包含以下核苷酸序列的3条探针：

探针1：5’-GCCCAAGAGTTTTCTTCTCATCGTTTGTTACC-3’SEQ ID NO:1

探针2：5’-GCAACTCCTTGAGGAATATGATCTAGAATTCC-3’SEQ ID NO:2

探针3：5’-GAACATAACATTTGCAATTTTAACTTGCTCTGG-3’SEQ ID NO:3

所述探针1、探针2、探针3在5’端修饰FAM。

所述的探针可用于检测鲤浮肿病毒，也可以用于制备鲤浮肿病毒检测试剂盒，试剂盒中还包括原位杂交检测试剂。

具体地，所述的鲤浮肿病毒检测试剂盒包括：上述原位杂交检测探针、蛋白酶K、预杂交液。检测方法如下：

所述鲤浮肿病毒检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)切片经热修复煮沸15分钟，滴加蛋白酶K(20μl/ml)室温消化20min，蒸馏水洗一次，PBS洗5min×3次；

(2)滴加预杂交液淹没，置于恒温42℃培养箱中2-3h；

(3)吸去多余液体后，滴加原位杂交检测探针混合液淹没切片，恒温37℃过夜；所述的原位杂交检测探针混合液，是将探针1、探针2、探针3溶解于可溶解的溶液(优选预杂交液)中，探针1、探针2、探针3的摩尔比为1：1：1，且工作时三种探针的总浓度为1.0μg/ml；

(4)37℃条件下经梯度SSC洗涤即2×SSC洗涤10min，1×SSC洗涤10min×2次，0.5×SSC洗涤10min×1次；