[发明专利]一种检测汉滩型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及一种检测汉滩型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒含有一种用于汉滩型汉坦病毒检测和分型的引物，其针对汉滩型L基因片段、汉滩型S基因片段、汉滩型M基因片段设计引物，每种型涉及两个靶点探针组和一个内标探针组。

技术领域

本发明属于医药生物领域，涉及一种检测病毒的检测，特别涉及汉滩型汉坦病毒的检测和鉴定。

背景技术

汉坦病毒(Hantavirus,HV)属布尼亚病毒科汉坦病毒属，是一种分节段的、单股、负链RNA病毒，其基因组由S(small)、M(medium)和L(large)三个片段组成。到目前为止，全世界已确定有23种汉坦病毒的血清型存在，且不同的汉坦病毒在致病性、疾病谱以及自然携带宿主上都各不相同。该病毒在临床上主要引起欧亚地区的肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)和美洲的汉坦病毒肺综合征(Hantavirus Pulmonary Syndrome,HPS)。

我国是肾综合征出血热的高发国家，每年报告发病人数在2-5万，占世界该病总数的90％以上。长期以来，汉滩型(Hantaan,HTNV)和汉城型(Seoul,SEOV)病毒是存在于我国的两个主要血清型，其宿主分别为黑线姬鼠(Apodemusagrarius)和褐家鼠(Rattusnorvegicus)。至2003年，在东北棕背中发现普马拉型汉坦病毒的存在；2007年，证实我国东北地区大林姬鼠携带Amur汉坦病毒，中国检科院于2009年亦在长白口岸鼠类证实Amur汉坦病毒的存在。

2019年我国北部重点口岸监测的鼠类动物自然感染病原体检测中，从葫芦岛口岸捕获的褐家鼠中检出肾综合征出血热病原体汉坦病毒核酸阳性4例(4/31)，均为汉城型病毒，带毒率为12.90％；从长白口岸的大林姬鼠肺组织检测出汉坦病毒核酸阳性5例(5/54)，为Amur型汉坦病毒，在大林姬鼠中汉坦病毒的带毒率为9.26％。

葫芦岛口岸2017、2018和2019年均从褐家鼠体内检测到汉城型汉坦病毒阳性。而病毒可通过宿主动物的血液、唾液、尿液及粪便排出，传播途径广泛，除加强鼠类密度监测外，还应对鼠携带病原体进行精准分型检测，以降低肾综合征出血热的传播风险。

目前汉坦病毒的检测方法主要有血清学检测方法(抗原检测、抗体检测)和核酸检测检测方法，包括免疫荧光法(IFA)、酶联免疫法(ELISA)、胶体金法、实时荧光RT-PCR法等。

免疫荧光法(IFA)是现行监测方案中推荐的宿主动物中汉坦病毒监测的方法，操作简便，但结果判断易受主观性因素影响，且存在不能用于高通量检测等问题；酶联免疫法具有较高的灵敏度，操作简单，适合高通量检测，便于临床日常检测与大规模的血清学流行病调查，但是其对汉坦病毒型别的判定存在不足；胶体金法具有简便、廉价等优点，适于基层单位和现场检测，但灵敏度低，只能定性，不能定量检测；RT-PCR法，具有高特异性、高灵敏度的优点，可以进行定量检测，并可进行型别判断，但其分析结果严重依赖循环阈值(Ct值)，无法准确检测低丰度样本。

本发明采用的数字PCR技术不依赖标准曲线和扩增循环阈值，可直接定量检测核酸，属于终点检测，某些程度上，扩增不会造成定量的偏倚，对PCR抑制剂更为耐受，在改善定量分析准确性和变异性上有较大优势；对于核酸含量极低的样品，检测灵敏度更高；并且通过微滴阅读和数据分析软件，可使微滴质控实现可视化，与RT-PCR法相比，更容易判断并剔除假阳性，提高了检测的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于汉滩型汉坦病毒检测和分型的引物。针对汉滩型L基因片段、汉滩型S基因片段、汉滩型M基因片段设计引物，每种型涉及两个靶点探针组和一个内标探针组。

本发明的目的在于提供一种用于汉滩型汉坦病毒检测和分型的引物，包括以下引物组：