[发明专利]牛源性成分定量分析标准质粒、制备及检测方法及应用

权利要求书

1.一种牛源性成分定量分析标准质粒的制备方法，其特征在于，步骤如下：将beef基因与ref基因串联得beef-ref基因，beef-ref基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，利用EcoR I和Bgl II内切酶酶切beef-ref基因和pUC 57质粒，再用T4 DNA连接酶将酶切后的beef-ref基因与酶切后的pUC 57质粒连接，即得beef基因和ref基因含量为1:1的标准质粒，标准质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。

2.权利要求1所述的制备方法制备的标准质粒。

3.利用权利要求2所述的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；

S2：配置20μl如下反应体系对提取的标准样品中的beef基因与ref基因含量进行数字PCR检测：不含dUTP的ddPCR Supermix for Probes 10μl，10μM上游引物1.8μl，10μM下游引物1.8μl，10μM探针0.5μl，模板1μl，ddH₂O 4.9μl；数字PCR扩增程序见下表：

之后根据beef基因与ref基因的数字PCR绝对定量结果，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，计算公式如下：

p％＝b_t÷r_t×100

其中p％为样品中牛肉成分含量；b_t为样品中beef基因绝对拷贝数；r_t为样品中ref基因绝对拷贝数。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中提取的标准样品中beef基因和ref基因的的定量限均为100拷贝数/μl，检测限为10拷贝数/μl。

5.利用权利要求2所述的标准质粒对肉制品中牛源性成分进行定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：将标准质粒转化入宿主细菌E.coli TOP10中，形成标准菌株；

S2：以标准质粒为模板，分别绘制beef基因标准曲线和ref基因标准曲线，beef基因标准曲线和ref基因标准曲线的制作方法均如下：将从步骤S1的标准菌株中提取的标准质粒进行10倍系列稀释，形成10²-10⁸拷贝数/μl的7个浓度梯度的标准浓度样品作为模板，按照下表配制PCR扩增体系，并按照下表中的PCR扩增程序用SYBR green试剂进行PCR扩增，之后以靶基因拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；

PCR扩增体系

PCR扩增程序

S3：以提取的标准样品DNA为模板，配置20μl如下反应体系对beef基因与ref基因含量进行RT-PCR检测：SYBR green Mix 10μl，10μM上游引物1μl，10μM下游引物1μl，模板1μl，ddH₂O 7μl；扩增程序见下表：

之后根据步骤S2中绘制的标准曲线计算提取的标准样品中的beef基因与ref基因的相对含量，得出被检测肉制品中总牛肉百分含量，具体计算公式如下：

p％＝k×(b_t÷r_t)×100

其中p％为样品中牛肉成分含量；k为校正系数；b_t为样品中beef基因绝对拷贝数；r_t为样品中ref基因绝对拷贝数；校正系数计算公式：k＝b_s÷r_s，其中b_s为标准牛肉样品中beef基因绝对拷贝数，r_s为标准牛肉样品中ref基因绝对拷贝数。