[发明专利]一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法

权利要求书

1.一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法，其特征在于：利用Cas9蛋白，基因组靶向特异性导向RNA，辅以一条两端带有短同源臂、中间插入在斑马鱼基因组中无相似序列的通用型终止翻译序列，来实现高效、精确、定点和定向的斑马鱼基因组插入式敲除；同时，提供特异的插入片段检测用引物，实现基因敲除的检测。

2.根据权利要求1所述的一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法，其特征在于：包括以下方法：

A、通用型特异终止翻译插入序列的设计和特异性分析；

B、同源臂合适长度的确定；

C、插入式敲除单链DNA模板（donor）的设计方法；

D、显微注射组分的配方；

E、插入式敲除阳性鉴定的引物设计方法；

F、插入式敲除快速阳性鉴定的方法。

3.根据权利要求1或2所述的一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法，其特征在于：具体包括以下方法：

（1） 通用型特异终止翻译插入序列的设计和特异性分析

小片段插入式敲除需要满足其在斑马鱼基因组中序列的特异性，利用插入序列的特异性，设计特异引物，与插入区域基因组引物搭配进行阳性鉴定，同时，还要满足实现不同的插入方式都能引入终止密码子序列；

（2）同源臂长度的确定

左臂的同源臂长度为18~50 nt，左臂的同源臂长度为18~22 nt；

（3）插入式敲除单链DNA模板的设计方法

利用Cas9蛋白在PAM附近引入固定的切点，设计出以切割处5’端为左臂，以切割处3’端为右臂的模板设计方法，具体为：NNNNNNNNNNNNNNNNN（切割处）NNNNGG；

（4）显微注射组分的配方

（5）插入式敲除阳性鉴定的引物设计方法

在引入的插入片段上设计并提供基于PCR的阳性鉴定方法，该引物搭配一条基因组特异的引物；

（6）插入式敲除快速阳性鉴定的方法

利用（5）设计的引物，提供一套插入式敲除快速鉴定的体系和PCR程序。

4.根据权利要求3所述的的一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的通用型特异终止翻译插入序列为gcagtcgctcactaactgagctaggcgaccgtgc，该序列命名为He Fragment。

5.根据权利要求3所述的的一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法，其特征在于：所述步骤（4）为将Cas9蛋白、sgRNA和donor，以合适的浓度配比混合成注射样品，储藏于-80℃冰箱中备用，用于打靶鱼胚胎注射。

6.根据权利要求3所述的的一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法，其特征在于：第一对鉴定引物，目的片段长度控制在200 bp-800 bp之间：

Genome F primer: 5’- 根据不同基因进行特异性设计-3’，

He R primer:5’- GCACGGTCGCCTAGCTCAGTTAGT-3’；

第二对鉴定引物，目的片段长度控制在200 bp-800 bp之间：

He F primer: 5’-CTCACTAACTGAGCTAGGCGACCG-3’，

Genome R primer:5’-根据不同基因进行特异性设计-3’。