[发明专利]一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法

权利要求书

1.一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)固定：取棉纤维样品投到装有4％戊二醛(0.1mol/L的磷酸缓冲液，pH7.2)的医用小瓶中先固定，后放到4℃冰箱保存至全部样品取完；

2)预包埋：将棉纤维进行预包埋，即将棉纤维从4％戊二醛取出在滤纸上拉直，用刀片切取中部长约0.3cm，用镊子放到包埋板中摆直，用3.5％(琼脂粉和0.1mol/L磷酸缓冲液配置)琼脂在包埋板中进行预包埋，凝固后切除多余的部分，只剩下包埋的纤维，再投到医用小瓶中；

3)冲洗：用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗样品3h；

4)脱水：分别经浓度为30、50、70、80、90、95、100％酒精逐级脱水，每级脱水20min，其中100％需脱水1h；

5)置换：再用1:1(酒精/丙酮)浸1h，1:5(酒精/丙酮)浸80min，纯丙酮浸1h，1:1(环氧树脂/丙酮)浸2h，3:1(环氧树脂/丙酮)浸3h，5:1(环氧树脂/丙酮)浸4d，纯环氧树脂(Epon812)浸1d进行置换；

6)包埋：用纯环氧树脂在包埋板中包埋材料，放到烘箱里分别在37、45、60℃下各放置1d；

7)切片：用德国LEICA ULTRACUTR切片机切片；

8)染色及观察拍照：2％醋酸双氧铀和6％柠檬酸铅染色各20min，双蒸水冲洗晾干后即可观察，用日本日立H-600透射电镜观察并拍照。

2.根据权利要求1所述的一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，其特征在于，分别收集不同发育天数的(10天，15天，20天，25天，30天，40天)的棉花纤维进行观察。

3.根据权利要求1所述的一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，其特征在于，分别将转基因株系和对照材料的成熟棉花纤维放入95％乙醇:乙醚(1:1)中脱脂10min后,再将脱脂后的毛样品置于100％乙醇中清洗2min,取出用滤纸吸干或自然干燥，用IB-5型离子溅射仪喷镀铂金膜,厚度10nm，在SUPRA 55VP型扫描电镜下观察棉花纤维形态并拍照。

4.根据权利要求1所述的一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，其特征在于，透射电镜和扫描电镜检测转外源GhCAD6基因检测改良棉纤维发育过程中的细胞壁及纤维表皮形态特征，从而得到纤维品质较好的转基因后代材料，可溶性糖含量显著降低的棉花转基因稳定遗传后代材料。

5.根据权利要求1所述的一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，其特征在于，所述转外源GhCAD6基因需满足透射电子显微镜观察转外源GhCAD6基因纤维细胞壁变薄，并且紧实度增加。

6.根据权利要求1所述的一种检测外源GhCAD6基因对棉花纤维细胞壁影响的方法，其特征在于，所述转外源GhCAD6基因需满足扫描电子显微镜观察转外源GhCAD6基因的纤维表面变光滑。