[发明专利]鉴别杨属树种的叶绿体基因组及其PCR扩增引物与应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，涉及植物种鉴别领域，公开一种能够特异鉴别杨属树种的叶绿体基因组序列及其PCR扩增的特异引物，包括杨树叶绿体基因组中9个高变区，分别为ccsA‑ndhD，ndhC‑trnV，ndhF‑ccsA，psbM‑trnD，psbZ‑trnfM，rpoB‑petN，rps15‑ycf1，ycf1和trnK‑psbK，其核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1～9，本发明的目的在于提供一种适用于鉴别杨属树种的叶绿体基因组9个高变区及其特异性引物，组合该9个高变区序列，能快速、准确地将杨属树种鉴别，为杨属树种鉴别提供了一种有效的DNA条形码。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及植物种鉴别领域，特别涉及一种能够特异鉴别杨属树种的叶绿体基因组序列及其PCR扩增的特异引物。

背景技术

杨树属于杨柳科杨属树种，因具有易栽培、生长迅速、适应性强、分布广和用途广等特征，成为最重要的绿化造林树种之一。然而，杨树由于派间及派内种间易于杂交，渐渗现象也普遍存在，且种内变异较为丰富，使得杨属树种仅通过表型性状进行鉴别存在较大的困难。

叶绿体基因组因其具有结构简单、重组率较低以及单亲遗传等特征被广泛用于系统发育关系研究。目前已有约50个杨树种或变种的叶绿体全基因组序列已公布，这些已公布的叶绿体基因组序列对于杨属树种的鉴别具有重要意义。然而，杨属树种叶绿体全基因组序列长度约150Kb，其扩增、测序和组装具有一定难度，方法比较繁琐，不利于推广。此外，一些叶绿体片段如atpF-H，matK，psbK-I，rbcL，rpoC1，trnL-trnF和trnH-psbA也被用作鉴定杨属树种的DNA条形码，但是单一片段序列在属或组水平上的鉴别率较高，而在种水平，特别是亲缘关系较近的杨属树种则很难被区分。因此，为高效地利用杨树资源，开发一种序列长度适中且能够有效鉴别杨属树种的DNA条形码非常必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于鉴别杨属树种的叶绿体基因组9个高变区及其特异性引物，组合该9个高变区序列，能快速、准确地将杨属树种鉴别，为杨属树种鉴别提供了一种有效的DNA条形码。

为实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：

鉴别杨属树种的叶绿体基因组，包括杨树叶绿体基因组中9个高变区序列中的至少五个，所述9个高变区序列分别为ccsA-ndhD，ndhC-trnV，ndhF-ccsA，psbM-trnD，psbZ-trnfM，rpoB-petN，rps15-ycf1，ycf1和trnK-psbK，其核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1～9。

本发明还提供了该叶绿体基因组或引物对在鉴别杨属树种中的应用方法，具体步骤如下：

(1)采集杨树叶片，提取基因组总DNA；

(2)以SEQ ID NO.1～9高变区的基因组序列，采用SEQ ID NO.10～27对应的引物进行PCR扩增；

(3)将得到的PCR产物取5μL经过1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，其扩增产物分子量大小与特异引物设计目的片段扩增长度相一致，且为单一条带，则说明PCR扩增成功；

(4)将扩增成功的9个高变区PCR产物送测序公司进行双向测序；

(5)得到的9个高变区序列，按一定顺序拼接，输入MEGA软件进行手动校对；

(6)校对后的序列导入IQ-tree软件中构建ML树；