[发明专利]一种用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法、解离试剂盒、解离方法

说明书

本发明公开了一种用于皮肤组织解离的混合酶，由胶原酶II、胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶I组成；所述胶原酶II的浓度为2‑4mg/mL；所述胰蛋白酶的浓度为1‑3mg/mL；所述脱氧核糖核酸酶I的浓度为0.01‑0.05mg/mL。此外，本发明还公开了用于皮肤组织的解离方法，将皮肤组织通过特定的缓冲液前处理，并采用上述特定的混合酶，进行组织解离，可高效、快速、稳定地获得单细胞总数多、活性好、碎片少、成团率低的皮肤组织单细胞悬液，本发明筛选优化的混合酶及浓度更具有针对性和高效性，相比广谱好几种胶原酶结合使用的方法更节约成本和时间，本发明为一直很难解离的皮肤组织样本的单细胞相关研究提供了良好的工具。

技术领域

本发明涉及单细胞测序技术领域，具体涉及一种专门用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法；此外本发明还涉及一种用于皮肤组织解离的解离试剂盒及解离方法。

背景技术

细胞是构成人体组织和器官的基本单位，在以往的研究中，大部分基因检测技术的方法是从对细胞集合性的研究，其得到的实验结果反映的是细胞群体中信号表达的平均水平，其实是针对细胞群体而产生的整体表征或者只是代表了细胞群体中在数量上占优势的细胞信息，从而忽略了单个细胞所特有的细胞异质性；然而已有大量的研究发现，在同种器官或组织中的相同类型的细胞也具有显著的异质性，并且每个细胞都具有各自独特的表达模式，细胞与细胞之间所蕴含的信息和表达水平千差万别；因此，使用细胞群体表达出的均值来进行描述的方法是不准确的，很可能会丢失或错误提示一些关键的表达信息；此外，传统的高通量测序的研究方法，难以应用在对自然界中难培养的微生物的研究、罕见循环肿瘤细胞的转录组分析、胚胎发生最早期的分化特征研究、肿瘤的非均质性和微进化研究等精确程度较高的研究领域；随着细胞分选和测序技术的进步，单细胞测序技术便应运而生并发展迅速，目前已是一大研究热点。

新一代测序技术单细胞测序技术（single-cell sequencing，SCS）是一种在单个细胞的水平上对基因组或转录组进行高通量测序并进行分析的一项新的测序技术；单细胞测序技术与传统的高通量测序相比较而言，其不但可以快速确定成千上万个细胞的精确基因表达模式，分析出相同表型的细胞的遗传信息，还可以获得珍贵样本的重要信息，具有极其广阔的应用前景，目前已应用于肿瘤、发育生物学、神经生物学、临床诊断、免疫性疾病、宏基因组学及微生态、生殖健康、新药研发等多个领域，《Science》杂志曾将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首；单细胞测序技术大致可以分为四类：单细胞全基因组测序、单细胞转录组测序、表观遗传测序、三维基因组测序，这四种测序类型也各具优势和特点，可以从不同维度、不同层面获得处于不同阶段的细胞特征性信息；单细胞测序技术在流程上包括：单细胞悬液的制备、单细胞分离和文库制备、测序、数据分析及可视化解读。

在任何单细胞研究中，单细胞悬液的制备过程都是极其关键的，此步也是单细胞测序技术首先需要解决的问题；细胞聚集导致成团率高，或者细胞死亡率高的样本，以及一些特殊样本容易出现的细胞碎片多等的情况都会影响最终的数据质量，导致科学研究者的错误解读；因此，对于特定的目标组织有其适合的最优实验方案；将组织裂解成单细胞悬液，传统方法一般有机械分离法和酶解法，悬液制备的难点主要有：如何保证解离下来的细胞具有高活性、如何保证细胞悬液结团少、如何保证最终上机的细胞没有碎片或有极少碎片；因此，对于不同的组织类型研究者们都会先优化出最佳的解离条件，特别是对于批间差异比较大的样本，其酶解时间和酶液的配比尤为重要，需要多次优化形成，在整个单细胞测序技术中是个性化比较强的一步。