[发明专利]一种猴B病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法

说明书

本发明公开了一种猴B病毒通用型TaqMan‑MGB探针实时荧光定量PCR方法。本发明提供了实时荧光定量PCR的成套引物和探针，由如下gD‑5F引物、gD‑5R引物和gD‑5P探针组成；所述gD‑5F引物为序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物；所述gD‑5R引物为序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物；所述gD‑5P探针为序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物。本发明设计能同时检测猴B病毒5种基因型的实时荧光定量PCR检测引物gD‑5F、gD‑5R与探针gD‑5P，利用其对猴B病毒或其gD蛋白进行检测，检测下限为10¹copies/μL，特异性好。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种猴B病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法。

背景技术

猴B病毒(monkey B virus，即macacine alphaherpesvirus 1)属疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、单纯疱疹病毒属。关于猴B病毒的基因型分型问题迄今尚无一致意见，最初有人认为仅存在3种基因型，之后陆续有文献分别报道了猴B病毒的第4种和第5种基因型，而国内有文献认为存在3种基因型，也有文献认为存在4种基因型。目前通过对猴B病毒基因型相关文献的调研，结合基于猴B病毒gB蛋白(UL27)、UL19蛋白的核苷酸序列系统发育分析结果，认为猴B病毒应分为5种基因型，且基因型与其宿主种系直接相关，分别为来源于恒河猴、日本猕猴、食蟹猴、豚尾猴和狮尾猴的猴B病毒。

猴B病毒是一种人畜共患病原。猴B病毒自然宿主是猕猴，在猴群中广泛存在，多呈良性经过。人类感染猴B病毒后可引起脑脊髓炎甚至致死，死亡率可高达80％。猴B病毒是目前确定的35种非人灵长类疱疹病毒中唯一一种已知对人有致病性的病毒。随着生物医学研究中非人灵长类动物(non-human primates，NHP)在生物医学研究中的应用越来越广泛，其对工作人员的健康及对试验研究的影响也日益受到重视。根据2011年我国颁布实施的实验动物微生物学等级及检测国家标准，猴B病毒已被列为普通级实验用猴应排除的病原微生物。因此，建立快速准确检测猴B病毒的方法对于暴露后的快速诊断和及时治疗以及对建立高质量的实验猴群都具有重要意义。

猴B病毒与同属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、单纯疱疹病毒属的人单纯疱疹病毒HSV-1、HSV-2具有高度相似性，导致针对猴B病毒的检测试剂常与HSV-1和HSV-2发生交叉反应，很大程度上影响了猴B病毒的检测特异性。

猴B病毒检测方法主要包括病毒分离培养、血清学检测和核酸检测。其中，病毒分离培养是猴B病毒感染检测的金标准，但是该方法灵敏度低、耗时长，并且由于猴B病毒是生物安全四级病原微生物，该方法仅能在国家规定的特定实验室进行。而猴B病毒与人单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、非洲绿猴疱疹病毒(simian agent 8，SA8)、狒狒疱疹病毒(herpesvirus papio 2，HVP2)存在的广泛抗原交叉性，常导致血清学检测结果出现假阳性。核酸检测方法由于其快速、灵敏、特异性高并且减少了病毒培养的危险性而具有很大优势。但是猴B病毒普通PCR检测方法需要对扩增产物进行电泳检测，或结合进一步的限制性酶切、杂交探针检测等手段进行特异性鉴定，操作步骤繁琐的同时也增大了污染几率。

实时荧光定量PCR法操作简便且灵敏度高，国内外已有少量猴B病毒qPCR检测方法的报道，但普遍存在猴B病毒检测引物探针特异性或通用性差的问题，易导致假阳性或假阴性检测结果的发生。

发明内容

为了实现猴B病毒的检测，本发明提供了如下新的技术方案：

本发明的一个目的是提供一种与人单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2无交叉反应的、对猴B病毒五种基因型均可进行定性和定量检测的实时荧光定量PCR的成套引物和探针。

本发明提供了实时荧光定量PCR的成套引物和探针，由如下gD-5F引物、gD-5R引物和gD-5P探针组成；