[发明专利]一种耐热溶菌酶及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种耐热溶菌酶，其通过将人源溶菌酶基因导入到毕赤酵母进行表达制备，所述毕赤酵母为HFD‑01，保藏编号为CCTCC NO:M2021148；本发明还涉及上述耐热溶菌酶的制备方法，包括：采用物理诱变和温度梯度驯化构建毕赤酵母HFD‑01、将热稳定的人源溶菌酶基因导入到毕赤酵母HFD‑01中以构建重组毕赤酵母菌株、采用重组菌株进行发酵培养以获得耐热溶菌酶；本发明还涉及上述耐热溶菌酶在制备动物饲料中的应用。本发明构建了耐受性好、耐热且生长速度较快的毕赤酵母HFD‑01，同时将热稳定的人源溶菌酶基因导入毕赤酵母HFD‑01，以获得较高温度下正常快速生长且能够高效稳定表达溶菌酶的菌株，本发明还对其工业发酵条件进行优化，提高溶菌酶产率及纯度，降低能耗。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种耐热溶菌酶及其制备方法和应用。

背景技术

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

目前应用最广泛的是鸡蛋清溶菌酶，鸡蛋清中含量丰富，抑菌功能显著，易于提取，且生产成本低，但是蛋清溶菌酶对热稳定性和变性剂的难受性较差，其作为饲料添加剂时，饲料造粒过程中有高温处理步骤，由于蛋清溶菌酶不耐受高温，活力受损，严重限制了应用。近年来，虽然市场上逐渐出现了利用微生物发酵的技术生产重组人溶菌酶，其对热稳定性和变性剂的耐受性有一定增强，且单位活力相对于鸡蛋清溶菌酶也较高，但其耐热性以及相关的抑菌性等方面还有待进一步提高；另外，现有的溶菌酶工业化生产工艺并不完善，其相关工艺条件有待进一步优化，发酵液中目标蛋白的分离浓缩技术也存在一定问题，这导致目的产物溶菌酶的纯度及产量均不理想。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，构建性能优异的毕赤酵母菌株，并利用生物技术将耐热性、抗逆性较好的人源溶菌酶基因导入到真核细胞毕赤酵母中进行表达，同时优化溶酶菌生产工艺和产物浓缩纯化工艺以得到产率较高的高纯度耐热溶菌酶。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一个方面是提供一种耐热溶菌酶，其通过将人源溶菌酶基因导入到毕赤酵母进行表达制备，所述毕赤酵母为HFD-01，其分类命名为毕赤酵母(Pichiapastoris)，其保藏编号为CCTCC NO:M2021148，保藏日期为2021年1月25日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

进一步地，所述溶菌酶在温度100～120℃下的活力损失率不高于15％，所述溶菌酶在温度80～100℃下的活力损失率不高于10％。

本发明的第二个方面是提供一种本发明的第一个方面中任一所述的耐热溶菌酶的制备方法，其包括以下步骤：

步骤A.构建毕赤酵母HFD-01，其保藏编号为CCTCC NO:M2021148；

步骤B.将热稳定的人源溶菌酶基因导入到步骤A构建的所述毕赤酵母HFD-01中，以构建重组毕赤酵母菌株；

步骤C.采用步骤B构建的所述重组毕赤酵母菌株进行发酵培养，产物进行浓缩纯化，以获得所述耐热溶菌酶。

为了进一步优化上述制备方法，本发明采取的技术措施还包括：