[发明专利]一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用

说明书

本发明提供一种甲醛裂合酶(FLS)的突变体蛋白，其通过理性设计和定点突变改造获得，具有较高的酶活力，其酶活力与原始甲醛裂合酶FLS相比提高了4.67倍；将该FLS的突变体蛋白应用于催化甲醛缩合合成1,3‑二羟基丙酮(DHA)具有较高的催化效率；本发明以FLS突变体蛋白为催化剂，酶法催化合成DHA，提高了DHA的产量。

技术领域

本发明属于酶的定向进化改造和生物催化应用技术领域，涉及一种甲醛裂合酶的突变体蛋白及其应用。

背景技术

1,3-二羟基丙酮(DHA)是目前发现的最简单的酮糖，是一种天然存在的，生物可降解的酮糖，是一种具有多功能的添加剂，可应用于化妆品、医药和食品行业。DHA可提供类似于紫外线(UV)诱导的棕褐色的暂时性色素沉着，是免晒黑皮肤护理制剂的有效成分，被广泛应用于化妆品行业。DHA是糖代谢的中间产物，在糖代谢过程中起着重要作用，与体重增加和脂肪减少，抗氧化活性以及增加耐力的能力有关，可用作猪饲料来降低猪体脂肪，提高瘦肉率。DHA还可应用与医药行业，如用于治疗白癜风，除此之外，更重要的是DHA是合成各种精细化学品和药物前体的重要前体，并且是多种精细化学品有机合成的多功能构建基块。

根据已发表的文献和专利，DHA的合成方法主要有化学合成法和微生物法两种。化学合成法是利用卤化物等盐类或金属催化剂或电催化剂来催化甘油转化为DHA的方法。在专利(CN107141208A)报道了一种1,3-二羟基丙酮的制备方法，在催化剂存在的条件下，将甘油和卤代试剂进行接触反应，制备得到1,3-二氯-2-丙醇，将1,3-二氯-2-丙醇进行氧化脱氢反应，得到中间产物1,3-二氯-2丙酮，将1,3-二氯-2丙酮与碱性物质在含水介质中接触进行水解反应，得到1,3-二羟基丙酮，此法用到的卤代试剂的毒性较大，对环境污染较为严重，且合成工艺复杂。微生物法多是以甘油或甲醇为原料，主要有两种途径：途径一，以甘油为原料，利用微生物(如大肠杆菌E.coli、产气克雷伯氏菌Klebsiella aerogenes和氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacteroxydans等)发酵过程中合成的甘油脱氢酶，脱去甘油分子第二个C原子上-OH的H变为C＝O以合成DHA；途径二，以甲醇为原料，利用微生物代谢产生的二羟基丙酮合成酶，将甲醇经氧化生成的甲醛和5-磷酸木酮糖催化转化为DHA和3-磷酸甘油醛。在专利(CN103789250A)提供了一种1，3-二羟基丙酮高产菌株及其构建方法，将1,3-二羟基丙酮高产菌株GOX205以氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H作为宿主，选择质粒pBBR1MCS-2作为载体，通过将编码甘油脱氢酶的sldAB基因转化进入宿主并进行表达将甘油转化为DHA。微生物发酵法具有制备周期长，产生较大的废液，效率低等缺点。体外酶法以甲醛为原料合成DHA的报道较少。

专利(201510446357.7)提供了一种具有催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮的酶及其制备方法，该方法是对苯甲酰甲酸脱羧酶进行改造。而甲醛裂合酶(FLS)是JustinB.Siegel等人(Justin B.Siegel，Amanda Lee Smith,et al.Proc Natl Acad Sci USA(2015)3704-3709，DOI号：10.1073/pnas.1500545112)对苯甲醛裂解酶对A28I，W89R，L90T，R188H，A394G，G419N和A480W改造得到的可将三分子甲醛缩合为DHA的酶，但其催化效率较低，Kcat/Km仅为4.7±0.1M^-1s^-1。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种用于外酶法合成DHA的高酶活或高催化效率的甲醛裂合酶(FLS)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的甲醛裂合酶(FLS)对催化甲醛转化为DHA催化效率低的问题，提供一种甲醛裂合酶的突变体蛋白，其通过理性设计和定点突变进行改造，具有较高的酶活力；将该FLS的突变体蛋白应用于催化甲醛缩合合成DHA具有较高的催化效率；并以原FLS及其突变体为催化剂，得到了催化甲醛缩合生产1,3-二羟基丙酮的方法。