[发明专利]BeSO4

说明书

BeSO₄染毒16HBE细胞差异表达蛋白检测与分析方法，涉及呼吸系统疾病实验研究领域，步骤如下：1、细胞培养；2、样品制备；3、蛋白还原处理；4、蛋白烷基化处理；5、蛋白酶解；6、对蛋白进行TMT标记；7、对样品进行LC‑MS/MS检测；8、GO和KEGG富集分析；9、PPI网络图分析。本发明利用TMT标记的定量蛋白质组学技术和生物信息学分析，筛选BeSO₄处理16HBE细胞前后的差异表达蛋白，分析了差异表达蛋白参与的生物学过程及重要信号途径，并进一步筛选了对后续研究具有重要参考价值的关键蛋白，为后续探究BeSO₄致16HBE细胞毒性机制及寻找潜在生物标志物提供了新方向。

技术领域

本发明涉及呼吸系统疾病实验研究领域，特别是一种BeSO₄染毒16HBE细胞差异表达蛋白检测与分析方法。

背景技术

铍(beryllium，Be)是有致癌作用的非放射性元素，近年来随着经济迅速发展，铍应用于工业领域范围正不断扩大，包括核工业、航天工程、信息技术行业，是一种严重危害职业人群健康的职业与环境毒物。

随着生产技术的革新和防护措施的加强，高剂量的铍暴露逐渐减少，而低剂量的铍暴露日益成为新的问题。铍化合物可致急性化学性肺炎、慢性铍病甚至肺癌，其中慢性铍病表现为以肺部肉芽肿或肺间质纤维化为主的病变。目前，铍的毒作用机制尚未完全阐明，铍病的治疗也仅是对症及支持治疗为主。

因此，铍化合物对健康的危害值得关注，深入研究铍化合物的毒作用机制对于防治铍病显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，而提供一种BeSO₄染毒16HBE细胞差异表达蛋白检测与分析方法，其从分子领域探索了BeSO₄染毒16HBE细胞的潜在生物标志物，对后续探究铍化合物的毒作用机制，以及铍病的诊断和治疗具有指导意义。

本发明的技术方案是：BeSO₄染毒16HBE细胞差异表达蛋白检测与分析方法，步骤如下：

S01、细胞培养：

取16HBE细胞，分为实验组和对照组分别进行传代培养；实验组的培养基中额外添加BeSO₄，并调节培养基中的BeSO₄浓度为150ug/ml；对照组的培养基不添加BeSO₄；48小时后分别收集实验组和对照组的细胞；

S02、样品制备：

a、将实验组和对照组的细胞分别置于离心管中，在每个离心管中分别加入200ul8M urea裂解液和3ul蛋白酶抑制剂，待裂解液与细胞充分接触后，超声震荡使细胞裂解，离心处理并分别收集每个离心管中的上清液，上清液中含有细胞内的蛋白质；

b、分别测定实验组和对照组的上清液中的蛋白质浓度，然后分别提取实验组和对照组的上清液，置入不同的超滤管内管中，确保每份提取出的样品中的蛋白质含量均为150ug；

S03、蛋白还原处理：

a、在各超滤管内管中分别加入10mM的DTT溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再分别将各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的溶液；

b、重复a分步骤至少两次，使裂解液被DTT充分置换掉；

c、将各超滤管置于37℃的孵育箱中1h，使超滤管内管中的蛋白质与DTT充分发生还原反应；

S04、蛋白烷基化处理：

a、在各超滤管内管中分别加入20mM的IAA溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再分别将各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的溶液；