[发明专利]一种单链DNA接头及其制备和应用

说明书

本发明公开了一种单链DNA接头及其制备和应用，属于分子生物学技术领；所述单链DNA接头包括一对完全互补的引物，所述引物的末端连接有简并碱基N，所述简并碱基N的数量为6～7个；本发明中所述单链DNA接头的连接是将所述的单链DNA接头的接头Mix与单链DNA，在冰上等体积混合，然后在37℃水浴中孵育15～20min，即可得到连接产物；本发明提供了一种单链DNA接头，通过一个6～7bp随机引物组成的粘性末端，能够与任何序列组合互补，该单链DNA接头能够在单链DNA的3'末端添加已知序列，不但适用于已知序列的单链DNA加接头，还能用于含未知序列的单链DNA加接头，因此在第二代测序技术中有很大的应用潜力。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种单链DNA接头及其制备和应用。

背景技术

二代测序(second generation sequencing)也称为下一代测序(nextgeneration sequencing，NGS)或大规模平行测序(massively parallel sequencing)，是一类测序技术的统称。二代测序技术主要由三个流程组成，包括建库、测序和数据处理。建库根据不同样本或检测目的分为全基因组建库、目标区段捕获建库、转录组建库等。测序又分为边合成边测序(sequencing by synthesis，SBS)和边连接边测序(sequencing byligation，SBL)两种策略。数据处理是将测序仪记录的碱基信号通过序列比对、局部比对和碱基质量校正等生物信息学处理后，用于进一步发现SNP、拷贝数变化CNV以及大片段的插入和缺失(insertion-deletion，indel)等结构突变(structural variation，SV)的过程。

在二代测序中，DNA加接头技术是一个非常重要的步骤。DNA加接头技术是指将一段已知序列DNA加到另一个DNA末端的过程，常用加接头的方法有扩增法和接头连接法，前者是将已知序列添加在上下游引物的5’端，然后通过PCR的方法引入接头序列，但该方法需要知道目标DNA两端的序列，这有很大局限性；后者依赖聚合酶类末端转移活性添加的A尾巴，通常需要先对DNA先进行末端修复，然后利用T4 DNA连接酶将含有突出的粘性末端与Y型引物接头连接。这是目前使用最广泛的连接头方法，但其并不适合单链DNA加接头。

T4 DNALigase是分子生物学工具酶的主力军之一，它以高效的双链DNA粘性末端或平末端连接活性著称。虽然T4 DNA Ligase也具有连接单链DNA-单链DNA连接活性，但连接效率比连接双链DNA低2个数量级(Kuhn H,Frank-Kamenetskii MD.Template-independent ligation of single-stranded DNA by T4 DNA ligase.FEBS J.2005Dec；272(23):5991-6000.)，这极大限制了其在单链DNA加接头中的应用。

单链DNA加接头研究不如双链DNA加接头广泛，但对于特殊DNA测序和研究是十分重要的，比如单链噬菌体DNA测序、单链环状病毒解析，RNA链被降解的cDNA分析等。T4 RNA连接酶能够直接连接单链DNA间的磷酸二酯键，但效率较低，应用不多。因此，单链DNA加接头还面临效率低、操作繁琐等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种单链DNA接头及其制备和应用，解决现有的单链DNA加接头面临效率低、操作繁琐等问题。

本发明的一个目的在于提供一种单链DNA接头。

所述单链DNA接头包括一对完全互补的引物，所述引物的GC含量在50～60％之间，所述简并碱基N的数量为6～7个。

进一步地，所述引物中的一条链的3’末端连接有简并碱基N，所述简并碱基中的最后一个碱基使用C3 Spacer修饰；所述引物中的另外一条链的3’末端和5’末端进行磷酸化修饰。