[发明专利]一种利用微生物发酵生产L-脯氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用微生物发酵生产L‑脯氨酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌中敲除L‑脯氨酸降解以及转运基因putA、putP、proP及aceA，构建得到的基因工程菌能够显著提升L‑脯氨酸的含量，于5L发酵罐中培养60h得到32.2g·L^‑1的L‑脯氨酸，L‑脯氨酸的生产效率提高至0.805g·L^‑1·h^‑1。

技术领域

本发明涉及一种利用微生物发酵生产L-脯氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-脯氨酸被广泛应用于医药、农业、化工等方面。传统L-脯氨酸生产方式为水解法，蛋白质经过酸、碱或者酶解后，得到各类氨基酸的混合物，可从中提取到所需的L-脯氨酸。所用的原料为橡皮鱼、明胶、毛发等，但由于生产和纯化的步骤多导致最终产率低，原料利用率低，而且生产的过程加入大量有毒化工原料，无法实现大规模生产。微生物生物技术研究的不断发展，生物下游工业的革新，各种化学工业技术的不断引进，使得氨基酸微生物发酵的成本越来越低，微生物生物发酵法为实现工业化大生产L-脯氨酸提供了有力的支持。现今，市场上的脯氨酸大部分是以工业微生物发酵所得。大肠杆菌作为一种模式微生物，用于各类氨基酸及化合物的发酵，但是L-脯氨酸发酵水平产量较低，若能得到高产L-脯氨酸大肠杆菌，具备工业放大潜力，有助于提升L-脯氨酸产能。

发明内容

针对目前L-脯氨酸发酵水平低的问题，本发明以E.coli BL21(DE3)作为出发菌株，利用CRISPR/Cas9敲除技术，实现因putA、putP、proP或aceA的无痕敲除，构建高效合成L-脯氨酸的重组菌株。

本发明提供了基因工程菌，其特征在于，沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因putA、脯氨酸-Na⁺协同转运蛋白编码基因putP、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因proP、异柠檬酸裂合酶编码基因aceA中的一个或多个。

在一种实施方式中，所述基因putA的基因locus号为B21_01024；所述基因putP的locus号为B21_01025；所述基因proP的locus号为B21_03943；所述基因aceA的locus号为B21_03847。

在一种实施方式中，所述基因工程菌如(a)～(d)所示任一：

(a)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因；

(b)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因和脯氨酸-Na⁺协同转运蛋白编码基因；

(c)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na⁺协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因；

(d)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na⁺协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因和异柠檬酸裂合酶编码基因。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株。

本发明提供了一种生产L-脯氨酸的方法，所述方法是以葡萄糖为碳源，利用所述基因工程菌发酵生产L-脯氨酸。

在一种实施方式中，将OD₆₀₀为10～20的基因工程菌，以发酵体系体积的5％～15％的量加入。

在一种实施方式中，所述发酵体中含有酵母抽提物、胰蛋白胨、NaCl、柠檬酸、葡萄糖、微量元素。