[发明专利]一类二倍半萜骨架化合物及其合成基因及制备方法

说明书

本发明公开了一种二倍半萜骨架化合物fusaoxyspenes合成基因fosA、二倍半萜骨架化合物合成酶及其应用，属于基因工程领域。该二倍半萜骨架化合物合成基因来源于尖孢镰刀菌14005(Fusarium oxysporum FO14005)，其基因、cDNA序列分别如SEQ ID NO.1和2所示，其编码的FoFS蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。FoFS蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能，该蛋白能催化DMAPP与IPP反应生成fusaoxyspenes。本发明发现的fosA基因催化产生新的五环二倍半萜骨架化合物，为丰富天然产物化合物库、发现新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种从尖孢镰刀菌14005(Fusariumoxysporum 14005)中克隆得到的五环二倍半萜骨架化合物Fusaoxyspenes合成基因fosA及其应用。

背景技术

萜类化合物是所有异戊二烯聚合物及其衍生物的总称，是小分子天然产物中最大的一类化合物，到目前为止已发现超过8万种。其中最引起我们关注的是二倍半萜，该类化合物数量较少，占萜类总数不足2％，绝大多数来源于海绵，在植物、真菌、地衣及昆虫分泌物中也有报道。二倍半萜类化合物大多具有广泛的生理活性，如消炎、抗菌、抗结核、抗癌和细胞毒活性等，在药物开发中具有良好前景。其生物合成过程与其他萜类化合物相一致：以二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)为起始单元，在异戊烯基转移酶(Prenyltransferase，PT)作用下与异戊烯基二磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)首尾连接形成不同碳骨架数目的线性多聚异戊烯焦磷酸前体如香叶基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphat，FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphat，GGPP)和香叶基法尼基焦磷酸(Geranylfranesyl pyrophosphat，GFPP)等，然后萜类环化酶(Terpene cyclase，TC)对这些焦磷酸前体进行环化或重排形成萜类骨架环化产物，然后进一步被各种后修饰酶催化反应生成各种萜类化合物。

从1965年至今发现约80种丝状真菌来源的二倍半萜化合物，这些化合物大多具有广泛的生理活性，在药物开发中具有良好前景。如：分离自Arthrinium sp.FA1744(ATCC74132)的双环二倍半萜terpestacin，具有显著的抑制血管聚合的活性，ID50为0.46μg/mL，明显优于阳性对照药硫酸葡聚糖(ID₅₀为12μg/mL)，研究表明terpestacin的作用靶点是位于线粒体复合物III上的UQCRB，通过抑制低氧引起的活性氧产量和细胞氧传感而发挥作用。Brady等以体外抗MRSA和VREF为导向，从一株内生真菌中分离鉴定一个新骨架二萜化合物guanacastepene。该化合物对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的大肠杆菌有显著的抗菌活性，有望开发成新型抗生素。真菌二萜中最著名的PAF拮抗剂是来自一株海洋真菌(Phoma sp.)的phomactin类成分(phomactinsA～J)，研究证明phomactin D活性最好，抑制PAF受体结合的IC₅₀为0.12μM，抑制血小板激活的IC₅₀为0.80μΜ¹¹。Chinworrungsee在对采自我国台湾的海洋真菌Halorosellinia oceanica的研究中发现其二倍半萜代谢产物halorosellinic acid有一定抗疟活性。Han J.J.等以体外抗炎活性为导向，从Cyathusafricanus的固体发酵粗提物中获得一系列新颖结构的鸟巢烷型二萜，其中化合物cyathinF和cyathin H具有优于阳性对照药氢化可的松的抗炎活性，IC₅₀分别为2.57和1.45μM。研究者从真菌Cyathus striatus中分离得到一类新的鸟巢烷木糖苷化合物striatoidA-F，在终浓度为10-40μM时，这些化合物具有一定的神经突起生长作用。