[发明专利]杜鹃花苯丙氨酸解氨酶PAL蛋白、编码基因及其基因克隆方法

说明书

本发明公开了一种杜鹃花苯丙氨酸解氨酶PAL蛋白及其编码基因，包括序列表的氨基酸序列及其编码基因；该基因在叶、雄蕊、雌蕊以及花瓣中均有表达，叶子中的表达显著高于其他组织；在不同发育阶段中，盛开期的表达量最大；本发明为今后利用基因工程技术改了植物品质、获得不同花香的植物提供理论依据，弥补了目前在杜鹃花研究的相关领域的空白，具有应用价值。

技术领域

本发明涉及杜鹃花花香合成途径中的关键酶与其编码基因，具体涉及一种杜鹃花苯丙氨酸解氨酶(PAL)蛋白以及编码基因和编码基因的克隆方法，属于生物技术领域。

背景技术

植物香气物质由许多低分子量、易挥发的化合物组成，是次生代谢的产物。运用顶空固相微萃取法分析云锦杜鹃花瓣中香气组成，发现苯环型物质相对含量最高。植物香气物质苯丙酸类/苯环型化合物主要由苯丙烷类代谢途径合成。苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷类代谢途径的关键限速酶，是植物次生代谢研究最多的酶。它以莽草酸为底物，通过肉桂酸途径生成反式肉桂酸，在甲基转移酶和酰基转移酶的共同作用下最终生成多种醛类和醇类。大多数花香化合物的生物合成过程非常复杂，是由多个酶在不同组织中共同完成，在目前的研究中，苯丙氨酸解氨酶对下游产生植香气物质基因的调控机制尚未清晰。

云锦杜鹃(Rhododendron fortunei Lindl.)是一种常绿灌木或小乔木，为中国特有的杜鹃属物种，主要生长在海拔600～2000m的山脊阳处或林下。它是常绿杜鹃亚属的代表种之一，也是杜鹃属植物种间杂种(品种)的重要祖先亲本，国内外很多杜鹃品种均与其有一定的亲缘关系。云锦杜鹃叶形大，花形美丽且清香，有较高的园艺观赏价值。作为少有的香气品种，云锦杜鹃开发潜力巨大，具有良好的产业化前景。

目前，已经从许多植物中克隆了苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)，例如拟南芥、枸杞、葡萄、大豆等。云锦杜鹃作为花香物质含量丰富的花科植物之一，对于云锦杜鹃花PAL基因的克隆、表达情况等相关报道并不常见。

发明内容

本发明的目的在于填补杜鹃花PAL家族成员的克隆、表达情况分析以及杜鹃花PAL蛋白以及编码基因的空白。

为了解决上述问题，本发明提供了一种杜鹃花PAL基因及其cDNA、gDNA以及氨基酸序列；

本发明提供了一种杜鹃花苯丙氨酸解氨酶PAL蛋白，包括：

(a)如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)在(a)中所示的SEQ ID NO:1的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有杜鹃花苯丙氨酸解氨酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了编码所述的一种杜鹃花苯丙氨酸解氨酶PAL蛋白的基因。

作为优选的方案，所述编码PAL蛋白的gDNA(全长)基因序列如SEQ ID NO:2所示。

作为优选的方案，所述编码PAL蛋白的cDNA(保守区)基因序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明解决的另一个技术问题是：提供了该杜鹃花苯丙氨酸解氨酶PAL基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取以及纯化杜鹃花瓣RNA；

(2)将杜鹃花瓣RNA逆转录获得cDNA第一链；

(3)利用一对引物对步骤(2)获得的cDNA第一链进行扩增得到cDNA序列，所述引物为：

(4)将提取的RNA进行逆转录合成得到合成3’和5’cDNA，以合成的cDNA为模板，利用引物进行扩增得到3’和5’序列，拼接后得到PAL基因全长序列。

作为优选的方案，所述步骤(3)中采用的引物为：

F1:AGTGATTGGGTGATGGAGAGCA