[发明专利]一种棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法

权利要求书

1.一种棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、根据公布的棉花基因组序列信息，设计单染色体或染色体区段的寡核苷酸混合池；

S2、寡核苷酸混合池经末端连接特异标记，获得标记的寡核苷酸混合池，即目标染色体或染色体区段的寡核苷酸混合探针；

S3、以S2获得的寡核苷酸混合探针，对棉花体细胞有丝分裂中期染色体进行非变性的荧光原位杂交。

2.如权利要求1所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，其特征在于，在步骤S1中，所述对基因组序列数据用Tandem Repeats Finder生物信息分析软件包，对已测序棉种每条染色体序列开展全基因组分析，匹配参数设置成2、7、7，分别对应匹配、错配、插入/删除，每条染色体的最小匹配值是50以识别重复序列，根据周期距离的片段大小将重复序列分成三类；用SPSS软件分析各棉种基因组染色体中重复序列的分布；

筛选各棉种Gypsy转座子种系特异性重复序列，建立各棉种Gypsy-RS分布的可视化数据库；在以上各棉种Gypsy-RS分布可视化数据库中，分离基于棉种染色体组、染色体或染色体区段的特异的寡核苷酸序列，设计一系列基于Gypsy-RS的寡核苷酸序列，构成寡核苷酸混合池。

3.如权利要求2所述的棉花寡核苷酸非变性荧光原位杂交方法，其特征在于，所述RS分成三类为20、20-60和60。

4.如权利要求2所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，其特征在于，所述SPSS软件为22.0版，SPSS，Chicago，IL。

5.如权利要求1所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，其特征在于，在步骤S2中，寡核苷酸混合池中各筛选的特异Gypsy-RS寡核苷酸序列，在5′端连接特异标记标记成荧光原位杂交探针，开展非变性的荧光原位杂交验证，使获得的寡核苷酸序列具有染色体或染色体区段特异性。

6.如权利要求1所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，其特征在于，在步骤S3中，非变性的荧光原位杂交为将寡核苷酸混合探针分别加入2×SSC 1×TE溶液作为杂交液，直接加在制备好的棉花体细胞有丝分裂中期染色体玻片上，进行杂交，杂交结束后，玻片直接放在2×SSC溶液中，塑膜盖片自然脱落；避光晾干，加入含有抗荧光衰减剂的DAPI，加上盖玻片，荧光显微镜观察。

7.如权利要求6所述的棉花中期染色体非变性荧光原位杂交方法，其特征在于，杂交为放入放42℃恒温箱杂交1～3h。

8.如权利要求1所述的棉花寡核苷酸非变性荧光原位杂交方法，其特征在于，获得的寡核苷酸混合池包括陆地棉A04、A06、A09、A10、D02和D08染色体特异的Gypsy-RS，序列如SEQID NO.1-6所示。

9.用于棉花中期染色体非变性荧光原位杂交的探针，其特征在于，其包括陆地棉A04、A06、A09、A10、D02和D08染色体特异的Gypsy-RS，序列如SEQ ID NO.1-6所示，探针的5′端连接荧光标记基团。

10.如权利要求9所述的探针，其特征在于，所述荧光标记基团包括FAM、TAMRA、JOE、CY3或ROX。