[发明专利]一种巴那沉香组织培养方法

权利要求书

1.一种巴那沉香组织培养种苗的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：

(1)选择外植体：选择巴那沉香半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5天以上晴朗的天气进行采集；

(2)外植体清洗及消毒：将步骤(1)中采集所得外植体茎段去掉叶片，用洗衣粉溶液浸泡10分钟并刷洗，漂洗干净后冲洗30分钟以上，转入超净台，放入酒精中浸泡15～30s，无菌水清洗2次，再将所述外植体放入浓度为0.1％的氯化汞溶液中，加入1～2滴吐温80，期间不停的摇晃，浸泡6～8min，无菌水清洗5～6次，即消毒完成；

(3)接种及培养：将步骤(2)中消毒完成的外植体的两端切口处切除，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，启动培养基为改良B5培养基中添加0.1～0.2mg/L 6-BA、0.05～0.1mg/LNAA和30g/L蔗糖，启动培养时间为30～40d；

(4)增殖培养：将步骤(3)中启动培养过程中萌出的侧芽切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基为改良B5培养基中添加0.2～0.4mg/L 6-BA、0.1～0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖，增殖培养30～35d后，获得增殖生长的芽苗；

(5)生根培养：待步骤(4)中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为改良B5培养基中添加0.8～1.5mg/LIBA、0.1-0.2mg/LNAA、0.1-0.3mg/LIAA和20g/L蔗糖，生根培养30～35d，获得生根的巴那沉香组培苗；

(6)炼苗移栽：将步骤(5)中获得的生根巴那沉香组培苗置于室外遮阴炼苗8-10d，培养基保湿，继续遮阴炼苗，5d后将巴那沉香组培苗移出，移出时先捏碎根系周围培养基后，用水漂洗干净残留的培养基，将巴那沉香组培苗用0.05％高锰酸钾浸泡10min，移栽至0.1％多菌灵喷洒消毒过的基质中，每天喷灌一次，直至移栽苗长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的巴那沉香植株；

其中，所述启动培养基、增殖培养基、生根培养基的基本培养基是改良的B5培养基，所述改良的B5培养基各组分及含量如下：

大量元素：KNO₃2000 mg/L，(NH₄)₂SO₄134 mg/L，NaH₂PO₄200 mg/L，MgSO₄·7H₂O 250mg/L，CaCl₂·2H₂O 200mg/L；

微量元素：KI 0.75mg/L，H₃BO₃3.0 mg/L，MnSO₄·4H₂O 15mg/L，ZnSO₄·7H₂O 5mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，FeSO₄·7H₂O+Na₂-EDTA·2H₂O；其中，FeSO₄·7H₂O的浓度为27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O的浓度为37.3mg/L；

有机成分：肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)1.0mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1)5mg/L，甘氨酸2mg/L，核黄素(维生素B2)10mg/L，泛酸钙1.1mg/L，抗坏血酸10mg/L，L-半胱氨酸5mg/L，叶酸0.2mg/。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述启动培养的过程包括暗培养和光培养，所述暗培养的时间为8d，所述光培养的时间为27d，总时长35d；所述光培养的光照强度2000～2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为60％。