[发明专利]一种人脐血或骨髓造血干细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的方法

说明书

本申请公开了从造血干细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的方法，包括：将CD34⁺造血干细胞在体外进行四个阶段的培养，其中阶段I为CD34⁺造血干细胞的扩增，阶段II为诱导CD34⁺造血干细胞向NK细胞前体的分化，阶段III为诱导NK细胞前体向NK细胞的分化，阶段IV为诱导NK细胞扩增及成熟，收集CD3^‑CD56⁺NK细胞，从而得到蜕膜样自然杀伤细胞，其中所述培养以含有细胞因子组合I的新鲜基础培养基开始，在培养的阶段I、II、III和IV分别使用含有细胞因子组合I、组合II、组合III和组合IV的新鲜基础培养基进行半量换液培养，其中所述细胞因子组合I为Flt3L和SCF；组合II为Flt3L，SCF和IL‑15；组合III为Flt3L，SCF和IL‑15；组合IV为IL‑15。

技术领域

本申请属于生物医药技术领域，具体而言，涉及将脐血(Cord blood,CB)来源或自体骨髓(Bone marrow,BM)来源的CD34⁺造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSC)体外诱导扩增，获得蜕膜样自然杀伤(Natural killer，NK)细胞的方法。

背景技术

胎儿作为母体的一种半同种移植物，妊娠过程中胚胎能够逃避母体免疫系统的排斥反应是妊娠建立的前提。随着滋养层细胞的入侵，子宫内膜的蜕膜化逐渐完成，形成母体和胎儿相互作用的母胎界面。早孕时期,免疫细胞约占母胎界面蜕膜组织的30％，其中蜕膜自然杀伤(decidual natural killer，dNK)细胞大量存在，所占比例高达70％。

NK细胞作为母胎界面主体免疫细胞，承担着重要生理功能。与外周血NK(peripheral blood NK,pNK)细胞相比，dNK细胞具有独特的表型和功能，即表现为CD56^brightCD16^-，并高表达组织居留NK细胞(Tissue-resident NK,trNK)标志分子CD49a，具有较强的分泌功能和低杀伤性等特性。母胎界面NK细胞参与诱导免疫耐受，可以促进滋养层细胞侵袭，参与螺旋动脉重建过程，促进胎盘和胎儿发育等。母胎界面蜕膜NK细胞活性功能异常，会导致病理性妊娠的发生。

蜕膜NK细胞的来源和数量有限，限制了其临床应用。目前尚未有大量获取蜕膜NK细胞的方法。一方面，早孕蜕膜组织中可分离得到的蜕膜NK细胞数量较少。另一方面，脐血与骨髓是HSC的重要来源，在一定条件下，其可以在体内和体外分化为NK细胞，尚未有报道完全解释蜕膜NK细胞发育分化途径，也没有通过造血干细胞体外大量诱导扩增蜕膜NK细胞的方法。将诱导扩增的蜕膜样NK细胞应用于临床，可为反复流产等妊娠疾病的治疗提供新思路新方法。

发明内容

本申请提供一种由脐血或自体骨髓来源的造血干细胞体外诱导扩增为蜕膜样NK细胞的方法以解决现有技术中蜕膜NK细胞来源不足、难以产业化生产的问题。具体而言，本申请提供了如下所示技术方案。

1.一种从造血干细胞体外诱导扩增蜕膜样自然杀伤细胞的方法，包括：

将CD34⁺造血干细胞在体外进行四个阶段的培养，其中阶段I为CD34⁺造血干细胞的扩增，阶段II为诱导CD34⁺造血干细胞向NK细胞前体的分化，阶段III为诱导NK细胞前体向NK细胞的分化，阶段IV为诱导NK细胞扩增及成熟，

收集CD3^-CD56⁺NK细胞，从而得到蜕膜样自然杀伤细胞，

其中所述培养以含有细胞因子组合I的新鲜基础培养基开始，在培养的阶段I、II、III和IV分别使用含有细胞因子组合I、组合II、组合III和组合IV的新鲜基础培养基进行半量换液培养，其中所述细胞因子组合I为Flt3L和SCF；组合II为Flt3L，SCF和IL-15；组合III为Flt3L，SCF和IL-15；组合IV为IL-15。