[发明专利]非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用，引物包括：上游引物ASFV‑F：5’‑CCACGGGAGGAATACCAA‑3’；下游引物ASFV‑R：5’‑GCAGATGCCGATACCACA‑3’；荧光探物ASFV‑P：含有片段5’‑TCATATTAACGTATCCAGAGCAAGA‑3’，并在5’端标记荧光报告基团，在3’端标记荧光淬灭基团。试剂盒包括荧光探针引物组、阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。应用具体为：1)提取待测样品的总DNA；2)以步骤1)中得到的总DNA为模板，利用试剂盒配制荧光反应体系进行荧光扩增；3)利用阳性对照建立标准曲线，并分析荧光扩增产物，根据扩增反应结果判定待测样品为非洲猪瘟病毒核酸阳性或阴性。与现有技术相比，本发明能够最大限度识别目前流行的所有ASFV毒株，且使引物的灵敏度提高到1.15×10¹copise/μL。

技术领域

本发明属于动物病原检测领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)引起猪的急性、发热、高度接触传染性疾病。家猪与野猪普遍易感，软蜱为ASFV的贮藏宿主和媒介。ASFV的潜伏期为5-15天，一旦爆发病程短，病死率高，可达100％。非洲猪瘟的临床症状复杂且难以与其他疾病进行区分，多表现为高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。非洲猪瘟发病后并没有有效的治疗措施，且非洲猪瘟病毒具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和抗体，也没有有效的疫苗防疫，因此建立一种快速、灵敏、准确的检测方法显得尤为重要。

ASFV是一种直径约为170-200nm的正20面体病毒，由内部的双链DNA和外周的衣壳及囊膜组成，大小约170～190kb。ASFV基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区，ASFV基因组大小变化由可变区决定。ASFV的整个基因组含有151个开放阅读框(ORFs)，可以编码150-200种蛋白质，大致可分成5大种类，包括分泌性蛋白、假定膜蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)的酶以及蛋白修饰的酶。P72蛋白是病毒的主要衣壳蛋白，位于ASFV的较保守的编码区，经过近半个世纪的遗传进化，仍保持较高的同源性，然而P72存在部分变异频率较高的区域，因此P72也被用于ASFV的基因分型。引物设计要避开变异区才能够有效地识别所有毒株。

发明内容

本发明的目的就是提供一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组、试剂盒及其应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种非洲猪瘟病毒P72基因的荧光探针引物组，所述引物组包括：

上游引物ASFV-F：5’-CCACGGGAGGAATACCAA-3’，如SEQ ID NO：1所示；

下游引物ASFV-R：5’-GCAGATGCCGATACCACA-3’，如SEQ ID NO：2所示；

荧光探物ASFV-P：含有片段5’-TCATATTAACGTATCCAGAGCAAGA-3’，如SEQ ID NO：3所示，并在5’端标记荧光报告基团，在3’端标记荧光淬灭基团。

所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

一种包含如上述所述的荧光探针引物组的试剂盒，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。

所述阳性对照为含有125bp目的片段的重组质粒；

所述阴性对照为无核酸水(即RNase free H₂O)；

所述PCR扩增液为荧光定量qPCR Mix(2×)。