[发明专利]一种高灵敏SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种高灵敏SARS‑CoV‑2中和抗体的检测方法、检测试剂盒，属于生物医学检测技术领域，本发明试剂盒包括层析试纸、卡壳和样本稀释液，所述层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫，所述NC膜上依次设置有捕获线、检测线和质控线，所述捕获线包被有ACE2蛋白，所述检测线包被有RBD蛋白，所述结合垫设置有RBD蛋白标记物；本发明采用阻断法加夹心法原理提高检测中和抗体的灵敏度，通过添加捕获线的方式，将靶向RBD的非中和抗体提前捕获，保证后续通过夹心法检测中和抗体的特异性。

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种高灵敏SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎，COVID-19）的病原为新型冠状病毒，属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，直径60～140nm。具有5个必需基因，分别针对核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）4种结构蛋白及RNA依赖性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因组构成核衣壳，外面围绕着病毒包膜（E），病毒包膜包埋有基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。刺突蛋白（S）通过受体结合位点（RBD）结合宿主的血管紧张素转化酶2（ACE-2）进入细胞。S蛋白是病毒进入人体的关键，是疫苗和治疗性中和抗体的主要靶点。S蛋白的受体结合（RBD）结构域可与宿主ACE2受体结合，介导病毒入侵宿主细胞，也是大多数有效的中和抗体的结合部位。

中和抗体与RBD结构域结合后，可使病毒失去吸附、入侵宿主细胞能力，从而抑制病毒在宿主体内复制传播的抗体，病毒中和抗体在清除宿主体内的病毒中起着重要作用。

传统中和抗体检测的“金标准”是感染抑制试验，主要是先将病毒与待检测抗体进行混合，再将混合物接种到敏感动物、胚胎或细胞，通过敏感动物、胚胎或细胞的病变情况来测定残存的病毒感染力，从而间接确定待检测抗体对病毒的中和效果。其中在体外进行利用活病毒进行蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralizationtest，PRNT）和通过检测细胞病变（cytopathic effct，CPE）量来进行分析的微量细胞中和试验是常用方法。

对于新型冠状病毒烈性病毒性传染病来讲，即使是体外实验也面临活病毒株来源和需要在高等级生物安全实验室操作的限制，杜克-新加坡国立大学医学院新发传染病重点研究项目主任王林发教授带领的研究团队，基于中和抗体可阻断RBD和ACE2结合的原理开发了阻断ELISA的cPass血清检测盒，由金斯瑞生物进行商业化推广，并获FDA授权用于恢复期血浆筛查。但仍存在检测操作繁琐、耗时长的缺点。之后，多家公司基于此原理开发了侧向层析试纸条，主要方法是将ACE2划到膜上，并用胶体金标记RBD蛋白。当样本中无中和抗体时候，胶体金标记的RBD和ACE2结合形成检测线。样本中有中和抗体时，中和抗体阻断RBD和ACE2的结合，从而降低检测线的显色强度。通过机器判读，或者检测线显色强度的深浅变化来判断中和抗体存在情况。肉眼判读时候需要检测线深浅有较大变化才能做判定，此形式检测卡的灵敏度有待提高。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中SARS-CoV-2中和抗体检测操作繁琐、耗时长，灵敏度低的技术问题，提供一种简便、快速、灵敏度高的SARS-CoV-2中和抗体的检测方法、检测试剂盒。本发明的技术方案如下：

一种高灵敏SARS-CoV-2中和抗体的检测方法，其特征在于，基于夹心法结合阻断法实现SARS-CoV-2中和抗体的检测。

优选的，高灵敏SARS-CoV-2中和抗体的检测方法通过提前捕获非中和抗体，增强后续通过夹心法检测中和抗体的特异性。

优选的，高灵敏SARS-CoV-2中和抗体的检测方法以ACE2蛋白为捕获物，阻断非中和抗体，通过形成包被RBD蛋白-中和抗体-RBD蛋白-标记载体复合物，实现SARS-CoV-2中和抗体的检测。