[发明专利]一种罗氏沼虾外源基因的表达质粒及其转录表达方法

说明书

本发明公开了一种罗氏沼虾外源基因的表达质粒及其高效转录表达方法，本发明表达质粒包括顺序排列的hr5增强子、转录启动子IE1、外源目标基因和终止子；hr5增强子核苷酸序列如SEQIDNo：1所示，转录启动子IE1核苷酸序列如SEQIDNo：2所示。本发明以10ug质粒每g虾体重的量，从沼虾腹部头胸甲和躯干交界线插入微量注射器并注射上述表达质粒，每只虾注射量控制在5μL～20μL的范围内；注射外源表达质粒4～12h后，采集罗氏沼虾躯干肌肉组织，并验证外源目标基因的表达量。本发明对鉴定罗氏沼虾外源基因肌肉内的转录表达水平更高，高出目前常用启动子IE1转录水平约3倍；并且对于外源基因活体表达的方法快捷高效。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种罗氏沼虾外源基因的表达质粒及其高效转录表达方法。

背景技术

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是世界上最大型的淡水虾之一。原产于印度洋-太平洋热带地区，自1976年引入后，产业规模不断扩大，市场需求不断上升。罗氏沼虾的性别决定属于ZW型，雌雄个体表型差异较大，雄性个体具有体型较大，且在生长速度、抗病性等方面都有着显著的优势，因此利用生物技术探索罗氏沼虾性别决定机理，对培育罗氏沼虾单性群体具有重要的意义。

由于罗氏沼虾细胞培养技术体系的缺乏，现有常用的脂质体转化、病毒转染进行基因功能研究的效率较低在甲壳类动物上，探索有效的外源基因表达体系是罗氏沼虾发育、繁殖等分子遗传机理研究的基础。目前，罗氏沼虾活体外源基因表达系统存在的问题有：(1)慢病毒表达体系能够携带外源基因进入对虾体内进行表达，但未发现表达效果显著提升的结果；(2)在虾类疾病(白斑病毒)研究过程中，发现其囊膜蛋白VP28启动子IE1在虾类体内具有较强的促转录表达作用，但是携带外援表达效率相对于病毒体系转录效率仍然低下不能满足外源基因功能研究的需要，而关于罗氏沼虾的外源基因高效表达启动子效果的研究尚未有报道。

随着罗氏沼虾转录组学、发育生物学等研究的需要，对于关键候选分子基因的功能验证，进一步探明候选关键功能基因作用研究，需要借助分子工具进行外源基因过表达和干扰试验，来进一步解释罗氏沼虾这一重要经济物种发育、繁殖生物学方面关键功能基因的作用，因此需要一种快捷高效的外源基因活体表达方法，来探索促进罗氏沼虾分子生物作用的揭示与丰富，也为罗氏沼虾开展基因功能验证研究提供必要分子工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种罗氏沼虾外源基因的表达质粒及其高效转录表达方法，旨在解决上述背景技术中现有技术的不足之处。

本发明是这样实现的，一种罗氏沼虾外源基因的表达质粒，该表达质粒包括顺序排列的hr5增强子、转录启动子IE1、外源目标基因和终止子；其中，所述hr5增强子为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒转录调控元件，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；所述转录启动子IE1为白斑病毒转录调控元件，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

本发明进一步公开了一种罗氏沼虾外源基因的活体肌肉内的高效转录表达方法，该方法包括以下步骤：

(1)以10ug质粒每g虾体重的量，从沼虾腹部头胸甲和躯干交界线插入微量注射器并注射表达质粒，每只虾注射量控制在5μL～20μL的范围内；该表达质粒包括顺序排列的hr5增强子、转录启动子IE1、外源目标基因和终止子；其中，所述hr5增强子为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒转录调控元件，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；所述转录启动子IE1为白斑病毒转录调控元件，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；

(2)注射外源表达质粒4～12h后，采集罗氏沼虾躯干肌肉组织，并验证外源目标基因的表达量。