[发明专利]高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌及其在合成α-酮戊二酸中的应用

权利要求书

1.高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，其特征在于：大肠杆菌宿主为表达L-氨基酸脱氨酶Pm1的Escherichia coli BL21（DE3），所述L-氨基酸脱氨酶Pm1通过质粒pET20b-N2-pm1-Q100I在大肠杆菌BL21中表达；

所述L-氨基酸脱氨酶Pm1的基因序列的N端融合了N端编码序列，且第100位的谷氨酰胺突变为异亮氨酸，形成所述质粒pET20b-N2-pm1-Q100I，所述质粒pET20b-N2-pm1-Q100I的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，所述质粒pET20b-N2-pm1-Q100I的构建方法，包括如下步骤：

（1）分子对接与饱和突变位点的选择

在 SWISS MODEL 数据库中搜索所述L-氨基酸脱氨酶Pm1的同源酶晶体模型，选择的所述同源酶晶体模型的同源性至少为90%；

利用Discovery Studio软件，将所述同源酶晶体模型的三维蛋白结构文件和底物L-谷氨酸的三维结构文件，进行分子对接；

选择关键位点进行定点饱和突变，设计引物，以质粒pET20b-pm1为模板，全质粒PCR扩增，将PCR产物分别转入大肠杆菌BL21中表达，进行催化验证，经筛选获得Q100I的正向突变菌株；

（2）融合N端编码序列的重组质粒构建

根据N端编码序列和pm1的基因序列，设计引物，以质粒pET20b-pm1-Q100I为模板，全质粒PCR扩增，将PCR产物分别转入大肠杆菌JM109中，测序验证，将构建成功的N端融合重组质粒分别转化入大肠杆菌BL21中，进行全细胞催化验证，获得正向突变的N2菌株。

3.如权利要求2所述的高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，其特征在于：

选中的所述同源酶晶体模型为模型5fjm.1A，所述模型5fjm.1A与L-氨基酸脱氨酶Pm1的同源性高达93.51%；

所述同源酶晶体模型的三维蛋白结构文件包括辅酶FAD的结构；

进行定点饱和突变选择的关键位点为Gln281、Phe318，分别对应L-氨基酸脱氨酶Pm1的Q100、W439、R316和Y98。

4.如权利要求1至3任一权利要求所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的应用，利用所述基因工程菌全细胞催化L-谷氨酸生成α-酮戊二酸。

5.如权利要求4所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的应用，其特征在于：所述基因工程菌全细胞的获得方法为，

将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，在25～37℃的温度环境中培养，以0.005～0.02 mM的IPTG进行诱导10～15h，离心收集获得基因工程菌全细胞。

6.如权利要求5所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的应用，其特征在于：将所述基因工程菌接种至发酵培养基时，种子液以OD值0.1～0.2的接种量接入发酵培养基中，当OD值达到2时，在25～30℃温度环境中，以0.01mM的IPTG进行诱导12h，离心收集全细胞。

7.如权利要求6所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的应用，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/L、酵母提取物24 g/L、甘油4 g/L、磷酸氢二钾2.31 g/L、三水磷酸氢二钾16.42g/L。

8.如权利要求6所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的应用，其特征在于：所述基因工程菌全细胞的催化方法为，

将离心收集的全细胞用缓冲液悬浮后，加入底物L-谷氨酸，在30℃温度环境中、220rpm的IPTG催化条件下催化反应24h。

9.如权利要求8所述的基因工程菌在合成α-酮戊二酸中的应用，其特征在于：催化反应在250mL的三角瓶中进行，催化体系总体积为25mL，细胞8g/L ，L-谷氨酸105g/L，缓冲液为pH为7.0的0.1M的磷酸钠缓冲液。