[发明专利]一株经紫外诱变育种产生的耐酒精型陆生伊萨酵母及其在葡萄酒酿造中的应用

权利要求书

1.一株耐酒精型陆生伊萨酵母，其特征在于，所述耐酒精型陆生伊萨酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称为UV5，保藏编号:CGMCC No.20635。

2.如权利要求1所述的耐酒精型陆生伊萨酵母在生产葡萄酒中的应用。

3.一种生产葡萄酒的方法，是利用如权利要求1所述的耐酒精型陆生伊萨酵母发酵葡萄原料，得到葡萄酒。

4.如权利要求1所述的耐酒精型陆生伊萨酵母的紫外诱变育种、筛选和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)活化冻存在-80℃条件下甘油管中的出发菌株，活化后按2％的比列接种于100mLYPD液体培养基中，28℃，120r/min摇床培养，每隔2小时无菌取样，测定菌悬液在600nm处的吸光值，不接种的空白YPD液体培养基作对照，以时间为横坐标，600nm处的OD值为纵坐标绘制出发菌株的生长曲线，确定其生长的对数期；

(2)取培养至对数中期的出发菌株菌悬液稀释涂布于YPD固体培养基上，打开皿盖，将平板放置于20w的紫外灯下距离50cm处照射不同时间(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120s)，辐照处理后，用锡纸包裹(防止光复活)培养基在28℃条件下恒温避光培养2天，进行菌落计数，计算致死率，选择致死率在80％左右的平板进行筛选；

(3)将筛选菌株的活化液稀释涂布到TTC下层培养基中，28℃培养48h后倒入TTC上层培养基，再于28℃下保温(阴暗处)3h后，选择颜色深的菌落；

(4)将TTC培养基筛选得到的诱变菌株酵母分别划线于酒精体积分数为4％v/v、6％v/v、8％v/v、10％v/v、12％v/v的YPD固体平板上进行酒精胁迫生长，然后在28℃条件下培养3天，观察平板上菌落的生长情况，以未处理的平板为对照；

(5)将酒精胁迫生长筛选得到的3株非酿酒酵母(H5、F26、D6)的活化液按2％的比例接种于不同酒精浓度的YPD液体培养基中，28℃，150r/min摇床培养，以不同处理下不接菌的YPD液体培养基为对照，每3h取样测定其在600nm处的吸光值，监测不同菌株在酒精胁迫下的生长速率；

(6)经紫外诱变育种、筛选后得到的菌株纯化后，使用40％甘油冻存管于-80℃条件下保存，待分子鉴定；

(7)提前活化待测酵母，将其接种于YPD液体培养基，于28℃，150rpm条件下恒温振荡培养12h，离心后取酵母细胞待用；使用天根酵母基因组DNA提取试剂盒提取待测酵母基因组DNA；选用引物对对酵母rDNA基因5.8S ITS区进行PCR扩增，取扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(8)PCR产物测序；

(9)通过美国国家生物技术信息中心网站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中的BLAST工具搜索待测菌株目的序列，进行相似序列搜索，根据同源序列的相似性初步确定UV5菌株的种属地位，同时校正测序图谱；比较UV5与已知酵母菌对应序列的相似程度，相似度超过99％，并通过UV5在WL鉴别培养基上的菌落形态和细胞显微形态最终鉴定待测菌株的种属地位。