[发明专利]基于Alpha技术高通量、多靶标筛查化学品核受体活性的方法

说明书

本发明公开了一种基于Alpha技术高通量、多靶标筛查化学品核受体活性的方法，涉及环境化合物的检测技术领域，该方法首先制备GST‑hNR‑LBD蛋白和Biotin‑SRC‑RID多肽，然后将预孵育的GST‑hNR‑LBD蛋白与受体微珠的混合物及待测物质进行黑暗第一次孵育，然后加入预孵育的Biotin‑SRC‑RID多肽与链霉亲和素标记的供体微珠混合物进行黑暗第二次孵育，最后利用Alpha方法快速测定不同浓度化学品的hNR受体活性。本发明方法测试通量高、特异性强、检出限低、具有超高灵敏度。

技术领域

本发明涉及环境化合物的检测技术领域，特别是涉及一种基于Alpha技术高通量、多靶标筛查化学品核受体活性的方法。

背景技术

环境污染日益严重，食源性疾病层出不穷，环境与食品安全问题已成为全球公众关注的焦点之一。其中，环境内分泌干扰物(Environmental Endocrine Disruptors，EEDs)可通过食物链放大作用在生物和人体内富集，干扰正常的内分泌功能，对人体造成持久的危害。这些污染物化学性质稳定，在体内外不易被分解，具有分布广、含量低、易富集、种类繁多及表现形式多样等特性，是对生物危害最大的环境污染物。大量实验证据以及流行病学调查研究表明，环境中许多外源性化学物质能够干扰人类和动物的内分泌机能，进而影响健康和生殖。

内分泌干扰物的研究已逐渐成为国际上健康和环境领域的研究热点，开发高效的环境内分泌干扰物检测方法具有重要的意义。近几年，测定环境中内分泌干扰物较常用的方法有色谱分析和光谱分析等方法。色谱分析方法如高效液相色谱、气相色谱、液相-质谱联用技术和气相-质谱联用技术等，光谱法测定环境内分泌干扰物主要有分光光度法、荧光法和化学发光等手段。尽管这方面已有诸多研究，但由于样品的基质复杂性及环境内分泌干扰物的低浓度等特点，现有的环境内分泌干扰物分析检测技术均存在选择性差、耗时长和成本高等缺点，极大地限制了它们的实际应用。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于Alpha技术高通量、多靶标筛查化学品核受体活性的方法，从而实现环境痕量污染物核受体活性的高效、高通量、多靶标、高灵敏快速检测。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案如下：

本发明提供一种基于Alpha技术高通量、多靶标筛查化学品核受体活性的方法，包括以下步骤：

(1)制备GST-重组人核受体的配体结合域(GST-hNR-LBD)蛋白，步骤包括：

用Trizol试剂提取人乳腺癌细胞MCF-7的总RNA，反转成cDNA并作为模板；

参考NCBI公布的人核受体的配体结合域hNR-LBD(Human nuclear receptorligand-binding Domain，hNR-LBD)的编码序列，设计引物扩增得到hNR-LBD DNA片段；

根据hNR-LBD DNA片段，利用大肠杆菌克隆得到GST-hNR-LBD蛋白；

(2)制备生物素-核受体转录辅助激活因子的核受体相互作用结构域(Biotin-SRC-RID)多肽，步骤包括：

利用多肽固相合成法(Solid Phase Peptide Synthesis，SPPS)合成核受体转录辅助激活因子的核受体相互作用结构域(SRC-RID)多肽；

合成结束后对SRC-RID多肽进行裂解，利用冷乙醚离心沉淀法进行沉淀，进一步利用HPLC进行纯化，再利用生物素标记试剂盒进行标记，获得Biotin-SRC-RID多肽；

(3)利用Alpha方法快速测定不同浓度化学品的hNR受体活性，步骤包括：

将GST-hNR-LBD蛋白与Anti-GST Alpha受体微珠按照体积比用分析缓冲液混匀，预孵育使GST-hNR-LBD蛋白标记在受体微珠上；