[发明专利]一种酿酒酵母表达人rPDGF-HSA融合蛋白及其标准品的制备方法

权利要求书

1.一种酿酒酵母表达人rPDGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-rPDGF-HSA的构建，具体包括：

设计并获得rPDGF-HSA基因序列和融合蛋白rPDGF-HSA的氨基酸序列；

根据rPDGF-HSA核苷酸序列设计并扩增目的基因，回收并双酶切PCR产物和pYES2/CT-MFα质粒，用T4 DAN连接酶连接，转入E.coli DH5α感受态细胞培养，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rPDGF-HSA；

(2)PDGF-HSA融合蛋白工程菌的制备、转化，具体包括：

酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；

将步骤(1)获得的pYES2/CT-MFα-rPDGF-HSA电转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-rPDGF-HSA；

(3)INVSc1/pYES2/CT-MFα-rPDGF-HSA工程菌的诱导表达和纯化，具体包括：

将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-rPDGF-HSA，通过培养、诱导表达，再依次经过金属离子亲和层析和阴离子交换层析纯化，即得本发明获得的酿酒酵母表达人rPDGF-HSA融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达人rPDGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，设计并获得rPDGF-HSA基因序列和融合蛋白rPDGF-HSA的氨基酸序列，具体步骤为：

根据pYES2/CT-MFα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计了人rPDGF-HSA基因序列和人rPDGF-HSA的氨基酸序列，人rPDGF-HSA基因序列如序列表1所示，人rPDGF-HSA的氨基酸序列如序列表2所示。

3.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达人rPDGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，根据rPDGF-HSA核苷酸序列设计并扩增目的基因，回收并双酶切PCR产物和pYES2/CT-MFα质粒，用T4 DAN连接酶连接，转入E.coli DH5α感受态细胞培养，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rPDGF-HSA，具体步骤为：

根据人rPDGF-HSA核苷酸序列设计扩增引物，其中：

正向引物：5'ATAAGAATGCGGCCGCAATGTCTCTAGGAA 3'；

反向引物：5'CTAGTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTG 3'；

进行PCR扩增；

配制1％琼脂糖凝胶，电泳分离PCR扩增产物，紫外灯下快速切下目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因PCR扩增产物；

提取DH5α/pYES2/CT-MFα中的pYES2/CT-MFα质粒；

将质粒pYES2/CT-MFα和回收的PCR产物分别用Not I和Xba I进行双酶切，并胶回收双酶切的PCR产物和质粒pYES2/CT-MFα；

将双酶切回收的PCR扩增产物与pYES2/CT-MFα质粒用T4 DNA连接酶在37℃中连接约30min；

将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞中，经Amp抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-rPDGF-HSA。