[发明专利]一种重组溶组织梭菌I型胶原酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白，其特征在于，包含溶组织梭菌I型胶原酶和连接到所述溶组织梭菌I型胶原酶N端的标签蛋白；所述标签蛋白包含串联的钙调蛋白结合肽(CBP)与链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)；所述标签蛋白通过柔性连接肽连接至溶组织梭菌I型胶原酶的N端；所述柔性连接肽氨基酸序列为SEQ ID NO:13GSGSGGTAMADIGSDDDDK；所述钙调蛋白结合肽(CBP)的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)的氨基酸序列为SEQ ID NO:7；所述标签蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2.如权利要求1所述的重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白，其特征在于，所述重组溶组织梭菌I型胶原酶融合蛋白所述氨基酸序列为SEQ ID NO:9。

3.一种编码如权利要求1所述的重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白的重组基因，其特征在于，包含溶组织梭菌I型胶原酶编码基因和位于所述溶组织梭菌I型胶原酶编码基因上游的标签蛋白编码基因，所述标签蛋白编码基因中包含编码串联的钙调蛋白结合肽(CBP)与链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)的重组基因；所述标签蛋白的编码基因为SEQ IDNO:4。

4.如权利要求3所述的编码重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:10。

5.一种重组溶组织梭菌I型胶原酶的制备方法，其特征在于，包括：

1)将标签蛋白的编码基因连接至溶组织梭菌I型胶原酶编码基因的上游，获得编码如权利要求1-2中任一项所述的重组溶组织梭菌I型胶原酶的重组基因；

2)将所述重组基因连接至骨架质粒中得到重组载体；

3)将所述重组载体转化到宿主菌中，得到重组工程菌；

4)将所述重组工程菌接种于发酵罐中，诱导表达；

5)当菌体和蛋白浓度达到预设阈值后，从培养物中分离纯化得到重组溶组织梭菌I型胶原酶；

6)利用蛋白酶将所述重组溶组织梭菌I型胶原酶酶解，去除标签蛋白；

7)将酶解后的样品依次经过Ni²⁺螯合层析、QFF层析、Butyl-Impres层析，获得重组溶组织梭菌I型胶原酶目的蛋白纯品。

6.权利要求1或2所述的重组溶组织梭菌I型胶原酶在制备用于治疗杜普征氏掌挛缩、佩罗尼病或橘皮组织的药物中的应用。