[发明专利]一种基于皮肤源脱细胞基质衍生支架及其构建方法

权利要求书

1.一种基于皮肤源脱细胞基质衍生支架的构建方法，其特征在于，所述的构建方法依次包括皮肤组织脱细胞处理、脱细胞基质溶液的制备和脱细胞基质/明胶/壳聚糖复合支架的构建三部分，步骤如下：

(1)皮肤组织脱细胞处理

将新鲜猪皮洗净后剪成小块，分别用胰蛋白酶溶液、Tirton-X-100溶液进行脱细胞，得到的基质用异丙醇溶液清洗，洗脱多余的脂肪；最后用一定酶活单位的DNase溶液进行完全脱细胞，过氧乙酸/乙醇溶液灭菌，再分别用PBS和蒸馏水在室温条件下洗涤，冷冻干燥，得到脱细胞基质dECM；所述的胰蛋白酶溶液为包含0.1～1.0wt％胰蛋白酶和1～5mM乙二胺四乙酸EDTA的PBS溶液，胰蛋白酶溶液进行脱细胞处理温度为10～50℃、时间为2～10h；所述的Tirton-X-100溶液为包含0.5～5.0wt％Triton-X-100和5～50mM EDTA的PBS溶液，Tirton-X-100溶液进行脱细胞处理温度为室温、时间12～60h；所述的DNase溶液为包含10～80U/mL DNase和5～40mM MgCl₂的PBS溶液，DNase溶液进行完全脱细胞的温度为10～50℃，时间为12～60h；所述的过氧乙酸/乙醇溶液为包含0.1～1.0％过氧乙酸和2～10％乙醇的水溶液；

(2)脱细胞基质溶液的制备

将胃蛋白酶和由步骤(1)得到的dECM按照1～8:20的质量比加入醋酸溶液中，并在4～40℃温度下搅拌溶解，得到浓度为0.5～4wt％的脱细胞基质dECM溶液；

(3)脱细胞基质/明胶/壳聚糖复合支架的构建

将明胶Gel和壳聚糖CS溶于醋酸溶液中得到Gel/CS溶液，其中每100ml醋酸溶液分别加入1～5g明胶、1～5g壳聚糖；

将Gel/CS溶液与步骤(2)得到的dECM溶液进行混合，其中，dECM、Gel、CS的质量比为0.5～4:1～5:1～5；采用NaOH溶液在低温条件下调节pH，避免凝胶和产生气泡，得到dECM/Gel/CS溶液；将dECM/Gel/CS溶液缓慢倒入24孔板，冷冻干燥；

采用交联剂交联，Na₂HPO₄中和多余的酸，PBS和蒸馏水清洗多次，冷冻干燥得到dECM/Gel/CS脱细胞基质衍生支架，即得到脱细胞基质/明胶/壳聚糖复合支架。

2.根据权利要求1所述的一种基于皮肤源脱细胞基质衍生支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(2)中：所述的醋酸溶液的浓度为0.5mol/L。

3.根据权利要求1所述的一种基于皮肤源脱细胞基质衍生支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)中：所述的醋酸溶液的浓度为0.5mol/L；所述的NaOH溶液的浓度为10mol/L；所述的Na₂HPO₄浓度为0.1mol/L。

4.根据权利要求1所述的一种基于皮肤源脱细胞基质衍生支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)中：低温条件为低于10℃。

5.根据权利要求1所述的一种基于皮肤源脱细胞基质衍生支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)中：所述的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC、N-羟基琥珀酰亚胺NHS、乙磺酸MES和乙醇的混合溶液，其中MES作为交联剂的缓冲液，EDC、NHS和MES的浓度均为50mmol/L，乙醇溶液的体积分数为10～80％。

6.一种基于皮肤源脱细胞基质衍生支架，其特征在于，所述的基于皮肤源脱细胞基质衍生支架由权利要求1-5任一所述的制备方法制备得到的；所述的基于皮肤源脱细胞基质衍生支架具有丰富的三维多孔结构，为大孔小孔相连和大孔包小孔的多孔结构，孔径主要分布于40-150μm；孔隙率90.36～95.47％；3s的接触角为52.0～68.9°；溶胀率501.43～944.95％；蛋白吸收率57.09～77.47％；压缩模量4.82～7.19MPa；在15d的溶菌酶降解率80.04～91.05％，具有良好生物相容性和较好的抗菌性能，适用于皮肤组织工程领域。