[发明专利]一种基于靶向捕获测序的猪50K液相芯片的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种基于靶向捕获测序的猪50K液相芯片的制备方法及其应用，所述猪50K液相芯片由独立包装的猪50K探针混合液和杂交捕获试剂构成，所述猪50K探针为DNA双链探针，是根据所筛选的SNP位点设计并合成的核苷酸序列；所述SNP位点是将猪的全基因组测序结果比对至猪参考基因组上进行SNP位点的筛选。利用本发明制备的猪50K液相芯片与猪DNA高通量测序文库混合，捕获猪DNA高通量测序文库中包含目标位点的DNA片段进行扩增和纯化，产物经过高通量测序后，利用测序结果回帖到猪参考基因组上进行比对，从而获取待测猪的基因组基因分型。采用本发明制备的50K液相芯片对猪只进行基因分型，可以解决现有技术成本高、不灵活、不能在我国猪场中的大规模使用的问题。

技术领域

本发明涉及基因分型技术领域，具体是一种基于靶向捕获测序基因型分型(Genotyping by Targeted Sequencing，GBTS)技术的猪50K液相芯片的制备方法及其对猪基因组进行基因分型的应用。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)具有数量多，分布广泛，易于快速规模化筛查，便于基因分型等特点，是继第一代限制性片段长度的多态性标记、第二代微卫星即简单的串联重复标记后的第三代遗传标记，被认为是当前最佳的标记选择，具有重要的生物学意义。目前，SNP标记已成为生物种群鉴定、遗传结构分析、功能性基因定位、基因组选择的重要工具。随着高通量SNP基因分型技术的发展，基于全基因组或简化基因组测序的方法成为SNP基因分型技术的主流。对于有参考基因组序列的物种，科研人员一般利用已知的序列设计SNP芯片，利用随机打断的基因组DNA片段与芯片上的寡聚核苷酸探针杂交，就可以获知对应位点的SNP基因分型。

目前，猪上成熟的商用SNP芯片主要基于Illumina平台和Affymetrix平台。前者主要有纽勤公司(NeoGen)开发的PorcineSNP60(含61565 SNP)、GGP-Porcine HD(68528 SNP，简称80K)、GGP-Porcine第二版(含51000 SNP，简称50K)、康普森公司设计的compassporcineSNP55(含55000 SNP)、江西农业大学设计的中芯1号(含51315 SNP)。Affymetrix平台主要有Affymetrix公司开发的高密度芯片，含大约650000 SNP，价格高昂，使用量很少。当前市场上主要以纽勤公司(NeoGen)的两款芯片使用量最大，但对分子育种实际应用而言，其价格仍然较高，而且不能根据自身群体调整标记，缺乏灵活性，限制了在我国猪场中的大规模使用。因此，我们急需一种新的基因分型技术降低高通量SNP芯片的制作成本，并能根据实际群体情况灵活调整SNP标记。

靶向捕获测序基因型分型(GBTS)是通过降低文库丰度实现仅对目标位点深度重测序的技术，它能够显著降低基因分型的成本，目前在猪上尚未开展应用。针对此，我们利用靶向捕获测序技术设计猪高通量SNP探针，将GBTS技术大规模推广至猪基础研究和分子育种应用中。基于GBTS技术，我们开发了全新的猪50K芯片，称之为液相芯片，与市场主流的基于illumina平台和Affymetrix平台开发的芯片(以下称之为固相芯片)相比，除了保留检测准确性高的优点和价格较低之外，它还有以下几个优势：完全国内自主知识产权，无政治贸易风险；开发的SNP芯片密度可以灵活调整，以主流的50K为基础，可以减少至低密度1K，也可扩展至高密度200K；可以随时补充新的位点，少量样本即可检测，无样本量限制；检测成本低于当前的固相芯片。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于靶向捕获测序的猪50K液相芯片的制备方法及其应用，同时提供了专用的SNP探针设计原则及猪全基因组50K液相芯片，采用本方法可以解决现有技术成本高、不灵活、不能在我国猪场中的大规模使用的问题。