[发明专利]一步法荧光检测体系及DNA糖基化酶活性的检测方法和应用

权利要求书

1.一种一步法荧光检测体系，其特征是，包括，

底物和模板：底物和模板均为单链DNA，底物含有8-氧鸟嘌呤，底物的3’端用NH₂修饰；模板由至少一条DNA1和至少一条DNA2交错连接形成，DNA1与DNA2中均不含腺嘌呤，DNA1与DNA2的连接处含有腺嘌呤脱氧核苷酸；底物与DNA1、一部分DNA2互补，与8-氧鸟嘌呤互补的胞嘧啶位于DNA1；

所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

APE1酶：用于切割AP位点；

DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物：用于在切除AP位点后3’OH端进行延伸反应，dNTP中不含dTTP；

UDG酶：用于清除延伸反应获得延伸产物中的尿嘧啶；

荧光染料：用于与扩增产物产生荧光。

2.如权利要求1所述的一步法荧光检测体系，其特征是，所述DNA聚合酶为Klenow大片段聚合酶；

或，荧光染料为SYBR Green II。

3.如权利要求1所述的一步法荧光检测体系，其特征是，底物的浓度为10nM时，模板的浓度为14～16nM；

或，底物的量为2×10^-4nmol时，APE1酶的用量为0.75～0.85U；

或，底物的量为2×10^-4nmol时，UDG酶的用量不低于2U；

或，底物的量为2×10^-4nmol时，Klenow大片段聚合酶的用量为1.9～2.1U；

或，底物的浓度为10nM时，dNTP/dUTP混合物的浓度为58～62μM。

4.如权利要求3所述的一步法荧光检测体系，其特征是，所述UDG酶的用量为2.0～2.2U。

5.一种DNA糖基化酶活性的检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1～4任一所述的一步法荧光检测体系、缓冲溶液。

6.一种权利要求1～4任一所述的一步法荧光检测体系在筛选hOGG1抑制剂中的应用。

7.一种权利要求1～4任一所述的一步法荧光检测体系在制备检测癌细胞试剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征是，所述癌细胞为A549细胞和/或HeLa细胞。