[发明专利]利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法

说明书

本发明提供了一种利用miR‑212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法，属于细胞工程和生物工程的技术领域，本发明以miR‑212为研究对象，首次实现利用miR‑212在猪卵巢颗粒细胞增值方面的方法，该方法包括步骤：将miR‑212转染入卵巢颗粒细胞中。本发明提供了一种显著的调控卵巢颗粒细胞的增值，本发明方法简单、易于实施推广。本发明的研究表明，通过对猪卵巢颗粒细胞进行分离、培养，转染miR‑212后显著促进颗粒细胞的增殖能力，为后续卵泡发育相关研究提供理论基础。

技术领域

本发明属于细胞工程以及基因工程技术领域，具体涉及一种利用 miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。

背景技术

卵泡颗粒细胞是卵泡发育和维持正常功能的重要条件，对维持卵 巢繁殖功能发挥着极其重要的作用。有研究者发现，卵泡闭锁退化的 过程是由卵泡中颗粒细胞的凋亡触发的，颗粒细胞的凋亡最终会导致 卵泡的闭锁。在卵泡颗粒细胞中可以分泌类固醇激素、促卵泡素和促 黄体素等激素，还可以产生一些细胞因子(孕酮、干细胞生长因子和 表皮生长因子等)，调控着卵泡和卵母细胞的生长发育。

在生猪生产中仔猪的出生率与生产的经济效益显著正相关，如何 提高产子数在现代猪遗传育种工作中都扮演至关重要的角色。目前对 于提高母猪产子数主要依赖遗传辅助标记选择，对于标志基因纯合或 杂合个体的筛选以及与产子性能较好的猪种如太湖猪等杂交育种，除 此之外暂无极为显著的提高方法。然而，母猪的产子数还与卵泡的发育相关，卵巢颗粒细胞直接影响卵泡的发育，因此探究影响卵巢颗粒 细胞增殖的条件在生产实践中对于促进卵泡发育、排卵具有重要意义。

miRNA是一类长度22nt左右的小分子绝大多数不具备编码能力 的小分子RNA，主要依赖于2-8位的种子序列与编码基因的3’端非 翻译区相结合，从而沉默复合靶基因发挥生物学功能。大量研究表明miRNA在调控卵泡发育、闭锁等生物过程中扮演重要角色，并且在 卵巢癌症等相关领域也有大量报道。然而，如何利用miRNA调控卵 巢颗粒细胞的增值，目前仍待研究。

发明内容

针对现有技术的缺点和需求，本发明的目的在于提供一种利用 miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。

为了实现上述目的，本发明提供的方案如下：

将miR-212转染入卵巢颗粒细胞中。

作为本发明的优选技术方案，在进行所述转染前，还包括分离、 接种、传代培养和收样操作。

作为本发明的一个实施方案，所述巢颗粒细胞为猪卵巢颗粒细胞。

作为本发明的一个实施方案，进行所述分离操作时，按照如下方 法进行：

1)于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在 38摄氏度的生理盐水中于1小时内分离卵巢颗粒细胞；

2)将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀 将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵 泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS 轻轻吹打均匀清洗离心重复两次；

3)配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％的 抗生素。

作为本发明的一个实施方案，在进行接种前，待卵巢颗粒细胞增 殖到85％后，弃掉原培养基，用PBS清洗两次后用巴氏吸管加入1ml 胰酶，放入37度细胞培养箱，放置2min后加入新鲜培养基终止消化， 将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管；最终将细胞用培养液冲 匀接种到12孔板中进行培养。

作为本发明的一个实施方案，在细胞转染前一天，将处于细胞接 种至12孔培养板中，当增殖细胞密度达到35～45％时，进行转染，48 小时候后收样。