[发明专利]基于肽图的单抗糖型检测方法

权利要求书

1.基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)采用超高压液相色谱-质谱采集肽图试样的质谱信号，获取不同糖型修饰的糖肽的分子量；

(b)对照含有各种糖型修饰的糖肽的分子量的数据库，确定所述不同糖型修饰的糖肽所对应的糖型；

所述肽图试样的制备包括：在液相环境中，采用变性剂和还原剂对单抗样品进行变性处理；再进行烷基化处理和酶切反应，然后终止酶切反应。

2.根据权利要求1所述的基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，还包括：获取所述质谱信号中不同糖型修饰的糖肽的强度，计算单个糖型修饰的糖肽的强度占所有糖型修饰的糖肽的强度的比例作为所述单抗样品中单个相应所述糖型所占的比例；

优选的，确定所述不同糖型修饰的糖肽所对应的糖型的方法包括：将获取得到的所述不同糖型修饰的糖肽的分子量与所述数据库中的分子量进行比对，以偏差＜10ppm为准进行初步判断，然后利用二级质谱数据进行确定。

3.根据权利要求1所述的基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，所述变性剂为含4～8M尿素、pH为11～12的1～2M的Tris-HCl溶液；

所述还原剂包括二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、β-巯基乙醇和巯基乙胺中的任一种或多种。

4.根据权利要求3所述的基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，所述单抗样品的浓度为0.8～1.2mg/mL；

优选的，所述变性剂的体积为所述单抗样品的体积的3倍以上；

优选的，所述还原剂的终浓度为10～30mM。

5.根据权利要求3所述的基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，所述变性处理的温度为50～60℃；所述变性处理的时间为30～120min。

6.根据权利要求1所述的基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，所述烷基化处理包括：所述变性处理后的物料冷却至室温，再加入烷基化试剂，于暗处条件下静置处理30～60min；

优选的，所述烷基化试剂的终浓度为20～100mM；

优选的，所述烷基化试剂包括碘乙酰胺。

7.根据权利要求1所述的基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，所述酶切反应包括：所述烷基化处理后的物料与酶混合后，于37～70℃条件下反应60～120min；

优选的，所述酶包括赖氨酸蛋白酶和/或胰蛋白酶；

优选的，所述酶与底物的质量比为1﹕(10～30)。

8.根据权利要求1所述的基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，加入酶切终止液终止所述酶切反应；所述酶切终止液包括甲酸；

优选的，所述酶切终止液的甲酸的终浓度为1wt％～5wt％。

9.根据权利要求1所述的基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，所述超高压液相色谱的条件包括：

色谱柱为反相色谱柱；柱温50～70℃；

流动相A为含0.05vt％～0.15vt％甲酸的水，流动相B为含0.05vt％～0.15vt％甲酸的乙腈；采用所述流动相A和所述流动相B对所述肽图试样进行梯度洗脱；所述梯度洗脱的流速为0.1～0.5mL/min；

所述梯度洗脱过程包括：从0min至40～50min，将所述流动相B的体积百分数由0.5％～2％提高至38％～42％；

优选的，所述梯度洗脱过程包括：从0min至40～45min，将所述流动相B的体积百分数由0.5％～2％提高至38％～42％；从40～45min至48～50min，所述流动相B的体积分数由38％～42％提高至93％～97％；从48～50min至52～53min，所述流动相B的体积分数为93％～97％；从52～53min至52.1～53.1min，所述流动相B的体积分数由93％～97％降至0.5％～2％；从52.1～53.1min至60～65min，所述流动相B的体积分数为0.5％～2％。

10.根据权利要求1所述的基于肽图的单抗糖型检测方法，其特征在于，所述质谱的条件包括：使用正离子模式扫描，一级质谱采用full scan进行扫描，二级质谱采用数据依赖性dd-MS2扫描模式采集数据；

优选的，所述一级质谱的参数：扫描范围m/z 200～2000，质谱分辨率17500，自动获取控制值3×10⁶，最大离子进样时间100ms，鞘气流速25～35L/min，离子传输管温度180～300℃；

所述二级质谱的参数：质谱分辨率17500～35000，最大扫描母离子数5，自动获取控制值1×10⁵～1×10⁶，最大离子进样时间250ms，碎裂能量20～40eV，自动获取控制值3×10⁶，动态排除时间8s。