[发明专利]辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2B4的制备方法及应用

权利要求书

1.辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2B4的制备方法，其特征在于辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2B4的制备方法按照以下步骤进行：

一、重组gD蛋白的制备；

二、纯化的重组gD蛋白免疫小鼠；

三、免疫鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合与单克隆抗体的筛选，得到2B4单克隆抗体；

四、2B4单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记，即完成了辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2B4的制备。

2.根据权利要求1所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2B4的制备方法，其特征在于步骤一中的重组gD蛋白的制备按照以下步骤进行：

一、提取牛疱疹病毒I型基因组DNA；

二、目的基因US6的扩增，引物序列如下：

gD-T1：5’-GGAATTCATGCAAGGGCCGACATTGG-3’

gD-T2：5’-CCCTCGAGCAGCGCGCTGTAGTTGACGTT-3’

三、重组菌的构建：PCR产物与T载体连接，连接产物转入感受态细胞，经过酶切鉴定，筛选阳性克隆，序列测定；Eco RI-HF和Xho I双酶切阳性克隆的质粒以及pGEX-6P-1，构建pGEX-6P-1-gD表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取阳性克隆，双酶切鉴定；

四、重组gD蛋白的表达纯化：将阳性克隆的培养液用IPTG诱导表达得到gD重组蛋白。

3.根据权利要求1所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2B4的制备方法，其特征在于步骤四单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记是按照以下步骤进行制备：

一、称取5mg HRP溶解于1mL蒸馏水中；

二、步骤一中的HRP溶液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20min；

三、将步骤二中的溶液装入透析袋中，对1mM pH 4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；

四、在向步骤三的过夜后的溶液中加20μL 0.2M pH 9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg单克隆抗体，在1mL 0.01M碳酸盐缓冲液中，避光轻轻搅拌2h；

五、再向步骤四的搅拌后的溶液中加0.1mL新配的4mg/mL NaBH₄液，混匀得到混合液，再置于4℃2h；

六、将混合液装入透析袋中，对0.15M pH 7.4的PBS透析，4℃过夜；

七、步骤六中过夜后的溶液在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置于4℃1h；

八、步骤七中静置后的溶液在3000rpm调节想离心0.5h，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗两次，最后沉淀物溶于0.15M pH 7.4的PBS中；

九、将步骤八的溶于PBS的溶液装入透析袋中，对0.15M pH 7.4的PBS缓冲盐进行透析，去除铵离子后，10000rpm离心30min去除沉淀，上清液即为酶标抗体。

4.如权利要求1所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体2B4在检测牛疱疹病毒I型抗体的应用。