[发明专利]一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法

说明书

本发明涉及一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法，包括以下步骤：乳腺组织采集、前处理、乳腺组织块的消化、接种、细胞纯化、细胞消化传代及细胞冻存。该分离方法使用酶消化组织块法分离猪乳腺上皮细胞，建立生长稳定的猪乳腺上皮细胞系，分离细胞所需时间短，所获细胞纯度高，无需反复纯化，只需纯化1‑2次即可得到高纯度的细胞；对细胞损伤小，获得的细胞活性高；细胞生长稳定，培养至第10代，细胞增殖率无显著变化，便于长期试验研究，为猪乳腺组织生理代谢机制研究提供稳定的试验材料。

技术领域

本发明涉及一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法，属于生物学领域。

背景技术

母猪乳汁是在催乳素刺激下由乳腺上皮细胞合成，并分泌进入乳腺腺泡腔，最后经由乳腺导管和乳头排出体外，因此乳腺上皮细胞是泌乳的核心。已有大量研究关注营养对母猪泌乳性能的调控作用，猪乳腺上皮细胞可作为营养调控母猪泌乳能力机理研究的有效生物模型。目前，人、鼠、牛的乳腺上皮细胞分离、培养技术日渐成熟，并且国内也能购得品质优良的细胞系，然而，猪乳腺上皮细胞分离技术起步较晚，并无纯度或活力较好的商品化猪乳腺上皮细胞系，这为母猪乳腺泌乳生理的深入研究带来一定阻碍。

当前，国内外已有部分研究报道了猪乳腺上皮细胞的分离方法，主要有“胶原酶法”和“组织块法”。这两种方法都存在一定弊端，“胶原酶法”主要利用胶原酶将乳腺组织充分裂解为单个细胞后进行培养，裂解的乳腺组织主要包含乳腺上皮细胞和成纤维细胞，需反复纯化若干次才可得到纯度较高的乳腺细胞，且胶原酶消化过程容易造成细胞的损伤，影响细胞活性；“组织块法”主要通过培养乳腺组织块至生长出新的乳腺上皮细胞进而分离培养，此法可较好的避免成纤维细胞污染和细胞损伤的问题，但获得大量乳腺上皮细胞所需要的周期较长。

因此，当前市场难以购买到纯度较高、活性较强的猪乳腺上皮细胞，而且现有的猪乳腺上皮细胞分离方法，存在分离细胞周期长、杂细胞较多、纯化繁琐、细胞损伤较大等问题，需要进一步研究猪乳腺上皮细胞的分离方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法，使用“酶消化组织块法”分离猪乳腺上皮细胞，建立生长稳定的猪乳腺上皮细胞系，可高效、快速提供活性高、生长稳定的研究材料。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法，包括以下步骤：

(1)乳腺组织采集：乳腺组织来自三元杂交母猪，将乳腺组织用无菌PBS缓冲液冲洗3次后，放入PBS缓冲液中，并置于冰盒，备用；

(2)乳腺组织前处理：将乳腺组织剪成1mm³的小碎块，用5mL无菌PBS缓冲液重悬，以1000g/min的速度离心10min，收集乳腺组织块，备用；

(3)乳腺组织块的消化：将乳腺组织块转移至无菌离心管中，按1:2的体积比加入乳腺组织块与质量分数为0.25％的胶原酶Ⅰ消化液，将离心管置于37℃恒温摇床，以100r/min的速度震荡消化3h；随后以1000g/min的速度离心10min，去掉上清液，收集沉淀；向沉淀中加入2倍体积的质量分数为0.25％的胰蛋白酶，置于37℃恒温摇床，以100r/min的速度震荡消化15min；最后加入10mL完全培养基终止消化，以1000g/min的速度离心5min，收集沉淀，备用；

(4)乳腺组织块的接种：使用移液枪将沉淀中的组织块均匀接种至培养皿中，组织块之间的间距为0.5cm，并吸掉组织块周围多余的培养基，每个组织块滴加50μL胎牛血清，待组织块贴壁后，加入完全培养基培养，此时乳腺上皮细胞开始生长，每48h更换一次培养基；