[发明专利]用于多倍体枇杷果肉颜色基因分型的引物及其分型方法

说明书

本发明提供一种用于多倍体枇杷果肉颜色基因分型的引物。本发明引物为针对等位基因设计的特异性引物，以基因组内拷贝数恒定的序列作为内参，对DNA序列进行扩增，并根据产物的量计算模板DNA序列的拷贝数量，可以实现对枇杷材料进行早期检测的效果。本发明使用针对EjPSY2Asupgt;d/supgt;缺失片段设计的EjPSY2A特异引物q2A以及针对EjPSY2A和EjPSY2Asupgt;d/supgt;设计的共同引物q2A/2Asupgt;d/supgt;进行q‑PCR扩增，并根据产物的量计算模板DNA序列的拷贝数量进行多倍体枇杷果肉颜色的基因分型，方法只需要一次q‑PCR即可快速、准确完成多个多倍体材料的果肉颜色性状基因型的检测，同时操作简便，成本低廉，技术准确度高。

技术领域

本发明涉及生物技术中的果树遗传育种技术领域，具体地，涉及一种用于多倍体枇杷果肉颜色基因分型的引物及其方法。

背景技术

多倍体育种是果树及较多作物育种的主要方法，其中多倍体杂交在新的多倍体材料创制中起重要作用。在研究及育种实践中，常会遇到多倍体材料部分关键性状基因型不明确的情况，这对多倍体亲本选配以及多倍体材料的利用有不利的影响。因此，多倍体基因型分析或多倍体重要性状的基因分型对多倍体杂交育种有重要的意义。

二倍体材料等位基因数量为2，其基因型组合仅有AA、Aa和aa(A表示显性基因，a表示隐性基因)3种类型，三倍体会有AAA、AAa、Aaa和aaa4种类型，四倍体则会出现AAAA、AAAa、AAaa、Aaaa和aaaa 5种类型，其它多倍体的基因型类型会更多。目前，基因分型的方法主要有：(1)、通过测交方法，利用性状分离规律对基因型进行分析；(2)、利用分子标记对基因型进行分析；(3)、通过测序方法进行基因型分析。第一种方法适合二倍体材料和多倍体材料，但这种方法耗时较长，需要至少一个世代的时间，无法进行早期检测。第二种方法仅适合二倍体，其原因在于电泳仅能识别纯合和杂合位点。二倍体会呈现3种带型组合，即AA、Aa和aa三种基因型的带型会不同，但是多倍体中AAa、Aaa、AAAa、AAaa以及Aaaa会呈现相同的带型，因此，分子标记不能对多倍体杂合基因型进行准确分型。测序技术虽然能较为准确了解多倍体的基因型，但其结果受测序深度的影响，测序深度越深，测序的成本越高，不适于大量材料的检测。

枇杷果肉颜色主要分为红肉和白肉。红肉枇杷品种中红色果肉性状受八氢番茄红素合酶(PSY2A)控制，为显性性状(A)；白肉枇杷品种中，由于该基因突变为PSY2A^d失去功能导致类胡萝卜素合成受阻，果肉呈现白色，为隐性性状(a)。与PSY2A基因相比，PSY2A^d的全长短694bp。目前已有基于分子标记鉴定枇杷果肉颜色的方法，比如中国专利CN 110607390A以及Weilin Wei等人的论文(DNA Markers Based on PSY Genes Can DifferentiateYellow-and White-Fleshed Loquats July 2016 Journal-American PomologicalSociety 70(3):165-168)。由于Aaaa、AAaa以及AAAa类多倍体的带型相同，故分子标记仅能鉴定二倍体枇杷的果肉颜色基因型，不能具体明确枇杷多倍体枇杷的果肉颜色的基因型。Aaaa类多倍体和AAaa多倍体与aa类二倍体杂交，后代中获得红肉和白肉材料的比例是不同的。故，明确多倍体枇杷果肉颜色的基因型，有助于在多倍体水平进行枇杷果肉颜色育种。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明提供一种用于多倍体枇杷果肉颜色基因分型的引物。本发明引物为针对等位基因设计的特异性引物，以基因组内拷贝数恒定的序列作为内参，对DNA序列进行扩增，并根据产物的量计算模板DNA序列的拷贝数量，可以实现对杂合红肉多倍体枇杷材料果肉颜色基因型进行检测的效果。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：