[发明专利]一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法。本方法利用金葡菌表面的A蛋白可与IgG的Fc片段特异性结合的原理，结合噻唑蓝(MTT)染色法，快速鉴定牛奶样品中的金葡菌。首先将IgG交联在琼脂糖微球上，进而与牛奶共孵育。经过短暂培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色。如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。该方法操作简单，检测特异性强，检测灵敏度高，对金葡菌的最低检测限介于50CFU/mL牛奶和5×10²CFU/mL牛奶之间，检测耗时短(约12h)，不需要昂贵的仪器设备。该技术方法对于临床上快速诊断奶牛金葡菌性乳腺炎具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明涉及金葡菌检测领域，具体涉及一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法。

背景技术

乳腺炎(mastitis)是泌乳奶牛最常见的疾病之一，不仅引起产奶量降低和用药成本增加，甚至可导致奶牛泌乳机能丧失而被迫淘汰，给奶牛业带来巨大经济损失。引起乳腺炎的病原菌种类繁多，其中革兰氏阴性菌以大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌为主，革兰氏阳性菌以金黄色葡萄球菌为主。通常情况下，大肠杆菌等革兰氏阴性菌感染可引起乳腺发生强烈的免疫炎症反应，受感染的乳腺可自然痊愈。相反，金葡菌则通常引起慢性乳腺感染，导致乳腺发生严重病变。此外，作为一种兼性胞内菌，金葡菌可逃避抗生素的治疗作用，采用抗生素治疗通常难以奏效。再者，金葡菌具有很强的传染性，可通过多种途径在牛群中传播。迄今，针对金葡菌的疫苗尚未研制成功。因而，要有效防控金葡菌性乳腺炎，必须做到早诊断、早隔离。

临床上常用的乳腺炎诊断方法有加州乳腺炎检测法(California mastitistest,CMT)、牛奶体细胞直接计数法、N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)或乳酸脱氢酶(LDH)检测法等。虽然这些方法可用于判定乳腺是否发生炎症，但均无法明确引起乳腺炎的病原。要明确病原，就必须进行细菌分离培养，并对病原菌进行鉴定。但常规细菌分离培养耗时长，也不适合大规模筛查。鉴于金葡菌性乳腺炎的严重危害，临床上急需一种操作简单、耗时较短、灵敏可靠的微生物学检测法。

发明内容

本发明提供了一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法。该方法利用金葡菌A蛋白可与IgG特异性结合的特点，将IgG交联在琼脂糖微球上，利用IgG-琼脂糖凝胶捕获牛奶样品中的金葡菌，经过短暂培养后，采用传统MTT显色法指示是否存在金葡菌。本技术方案中利用琼脂糖微球具有较大的比表面积这一特点，实现对牛奶中痕量细菌进行有效捕获。

一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：

1)制备琼脂糖微球；

2)将IgG交联在琼脂糖微球上；

3)将交联有IgG的琼脂糖微球加入到待检测牛奶样品中，经过培养以扩大细菌数量后，采用MTT法进行显色，如果MTT转变为紫色，则提示样品中含有金葡菌。

步骤1)中，所述的琼脂糖微球的制备包括：

(1.1)水相配置：将琼脂糖加入含NaCl的生理盐水中，微波加热至溶液变澄清，置80℃～95℃水浴保温以去除气泡，得到水相；

步骤(1.1)中，所述的水相中琼脂糖质量分数为1％～4％，进一步优选为2％；

所述的含NaCl的生理盐水中NaCl的质量分数为0.3％～2％，进一步优选为0.9％。

进一步优选，置90℃水浴保温以去除气泡。

(1.2)油相配置：配置含Span80的液体石蜡，搅拌均匀后，加热至60℃～80℃，得到油相。

步骤(1.2)中，所述的油相中Span80的体积百分数为1％～5％，为3％。

加热至65℃～75℃，最优选，加热至70℃。