[发明专利]用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明属于生物检测技术领域，提供一种用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针及试剂盒，所述的引物、探针由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID No.1至SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的引物，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的探针。所述探针的5’端标记HEX，3’端标记BHQ1。本发明建立了一种高灵敏度的快速准确的检测方法，方法不依赖阳性标准品，检测过程无需标准曲线，不依赖于Ct值即可对病毒载量进行绝对的定量分析，进一步提高了GI型诺如病毒的检测水平。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地，涉及一种用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针及试剂盒。

背景技术

诺如病毒(Norovirus，NoV)是引起急性非细菌性胃肠炎的主要病原之一，诺如病毒具有致病率高、感染剂量低、对外界抵抗力强等特点，使得诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童。常见果蔬(草莓、生菜等)和贝类(牡蛎、青口等)已被列为诺如病毒污染的高风险食品。

诺如病毒归属于嵌杯病毒科(Caliciviridae)诺瓦克样病毒属(Norwalk-likevirus)，该科病毒包括5个属，分别为诺洛病毒、诺瓦克病毒、兔出血病病毒、札如病毒和鼠疫病毒。该病毒为单股正链RNA病毒，无包膜，基因组长度约为7.6kb，在电镜下观察，其结构为小圆形的病毒粒子。是一种单链RNA病毒，无囊膜，直径大约27～32nm。诺如病毒含有40多种不同的病毒株，根据其基因特征，主要分为6个基因型，GⅠ到GⅥ，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ基因型主要感染人类，而GⅢ和GⅤ可感染猪、牛和鼠。依据病毒衣壳蛋白(VP1)序列和RNA依赖的RNA聚合酶多态性的配对分布，每个基因型可进一步分为不同的基因亚型，GⅠ有8个基因亚型，GⅡ有至少17个，其中基因型GⅡ，亚型4的诺如病毒(GⅡ.4)，占目前全世界流行的诺如病毒的70％-80％，主要引发人感染病毒性肠胃炎，GⅡ.4可通过定期的点突变或基因重组积累而产生新毒株，表现出基因/抗原的多样化，几乎是每隔两三年便会出现新的变异株，从而引发大的流行。

诺如病毒引起人类感染的主要是GI和GII群，感染者发病突然，主要症状为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻，也可见头痛、寒颤和肌肉痛等症状，严重者可出现脱水症状。贝类(牡蛎、青口螺等)已被列为诺如病毒污染的高风险食品。贝类是生长在港湾的双壳软体动物，易受到流入海水的淡水的污染，当人们生食或食用加热不彻底的贝类时，就有可能受到感染。根据国外流行病学调查和实验室验证，许多胃肠炎暴发疫情都与生吃生蚝等贝类食品有关，因此，贝类产品中诺如病毒的检测，对于保障食品安全致关重要。

目前，诺如病毒的检测方法中实时荧光PCR是公认的最好的广泛应用的检测方法。但是，实时荧光PCR检测有时在样品中仅存在痕量诺如病毒的情况下，往往检测结果不稳定。由于食品中的病毒量往往很低，检测灵敏度的提高至关重要，ddPCR能弥补实时荧光PCR的这些缺陷，进一步提高检测的敏感性和结果稳定性。

中国专利“201610632652.6、一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒及检测方法的专利”中，公开了一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒及检测方法。该技术方案利用微滴式数字PCR技术精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的检测方法，该方法无需依赖有证标准物质或其他标准品，具有更高的精确度、灵敏度和重复性，易于标准化。其引物和探针的设计方法为：选取诺如病毒分型基因片段RdRp-VP1，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Prime Express软件V4.0(ABI,Foster City,CA,USA)设计出10余对引物和探针组合，经过筛选最终获得特异性强、适用于RT-ddPCR引物/探针组合各1套，其中探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ。