[发明专利]苜蓿盲蝽AlinOR30基因的构建表达、寄主挥发物的筛选及用途

说明书

本发明公开了苜蓿盲蝽Al inOR30基因的构建表达、寄主挥发物的筛选及用途，所述方法包括设计引物，构建表达载体；载体线性化及纯化；cRNA合成；获得体外合成的Al inOR30和Al inORco cRNA。基于克隆和真核表达的方法成功表达出了苜蓿盲蝽Al inOR30，为苜蓿盲蝽气味受体的功能提供了材料，并通过双电极电压钳技术检测了该受体对寄主植物挥发物组分的识别能力，筛选出了3种Al inOR30的气味配体，进一步行为学试验筛选出了一种具有行为吸引活性的配体‑水杨酸甲酯。从分子和个体行为层面为苜蓿盲蝽的行为调控剂的研发提供了材料，为苜蓿盲蝽绿色防控技术的开发和应用奠定了基础。

技术领域

本发明属于利用昆虫的嗅觉系统来设计行为调控剂进行害虫绿色防控的技术领域，特别涉及苜蓿盲蝽AlinOR30基因的构建表达、寄主挥发物的筛选及用途。

技术背景

基于植物挥发物设计的苜蓿盲蝽行为调控物质的研究已有报道，但嗅觉受体在苜蓿盲蝽寄主定位中功能的研究甚少，基于此筛选的行为调控剂的应用也未见报道。

发明内容

鉴于现有技术的缺陷，本发明旨在于提供蓿盲蝽AlinOR30基因的构建表达、寄主挥发物的筛选及用途，通过基于克隆和真核表达的方法成功表达出了苜蓿盲蝽AlinOR30，为苜蓿盲蝽气味受体的功能提供了材料，并通过双电极电压钳技术检测了该受体与寄主植物挥发物组分的识别能力，筛选出了3种AlinOR30的气味配体，进一步行为学试验筛选出了一种具有行为吸引活性的配体-水杨酸甲酯。从分子和个体行为层面为苜蓿盲蝽的行为调控剂的研发提供了材料，为苜蓿盲蝽绿色防控技术的开发和应用奠定了基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

苜蓿盲蝽AlinOR30基因的构建表达的方法，所述方法包括设计引物，构建表达载体；载体线性化及纯化；cRNA合成；获得体外合成的AlinOR30和AlinORco cRNA。

需要说明的是，所述引物如下：

本发明还提供一种苜蓿盲蝽OR30基因的构建表达的方法筛选寄主挥发物的方法，所述方法包括：

a将非洲爪蟾置于冰的麻醉液中20-30min，麻醉后置于冰上，碘酒擦拭肚皮右下方靠右腿处，切1-2cm伤口，暴露出卵巢，将体外合成的AlinOR30和AlinORco cRNA注射到爪蟾卵母细胞；

b用消毒的镊子小心取出卵巢中的1/3的卵细胞组织，将组织置于1×Ringer缓冲液中；用缝合线将伤口缝合，置于浅水中恢复；

c胶原酶处理细胞组织，16℃孵育1h。用洗液清洗3次，用孵育液清洗3次，再将卵细胞移至盛有孵育液的培养皿中16℃过夜培养；

d次日上午，选取直径1mm的卵细胞(Ⅴ和Ⅵ期)。每枚卵注射23nl OR30 cRNA和23nl ORco cRNA，浓度均为1μLg/μL，注射后及时更换孵育液；

e记录，将一枚卵放入浴槽中央，插入电流和电压电极，用气味物种刺激卵母细胞，记录膜电压变化；其中，OC-725C oocyte clamp记录的数据由Digidata 1440A获取，利用软件pCLAMP10.2对数据进行处理分析。

需要说明的是，AlinOR30/AlinORco三种寄主挥发物产生电生理反应，包括水杨酸甲酯、环己基丙烯酸酯和乙酰苯。

作为本发明的用途，本发明还可以提供一种利用AlinOR30基因筛选出的活性配体水杨酸甲酯用于田间苜蓿盲蝽的绿色防控。