[发明专利]乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法

说明书

本发明涉及一种乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法，包括以下步骤：称取乙二胺四乙酸二钠加入无菌氯化钙溶液中制成供试液；准确量取适宜稀释级的供试液至无菌过滤器内，开启真空泵和阀门进行过滤，再用无抑菌性的淋洗液淋洗滤膜；过滤完毕，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于TSA培养基、SDA培养基表面倒置培养，定时观察菌落生长情况，点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。本发明采用薄膜过滤法和中和剂来去除乙二胺四乙酸二钠的抑菌性，本发明方法能够有效检出乙二胺四乙酸二钠中的微生物污染，为该原料的质量控制提供了保障。

技术领域

本发明涉及一种微生物限度检查方法，具体地说是一种乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法。

背景技术

乙二胺四乙酸二钠是常用的无菌药品所用原料之一，需对其微生物限度进行检查。根据2020版中国药典1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的要求，供试品检查方法主要有平皿法和薄膜过滤法，其中薄膜过滤法需要供试品能完全溶解于稀释液中，乙二胺四乙酸二钠溶解度较低(约为110g/L)且在室温时溶解较慢，无法满足薄膜过滤法的要求，因此常规检验时一般采用平皿法，平皿法的具体步骤如下：

供试液的制备：准确称取10g供试品，加入100mL、pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀制成稀释度为1:10的供试液；

平皿法检查：准确量取1ml供试液转移至直径9cm的无菌平皿中，再加入15～20ml温度不超过45℃融化的TSA或SDA培养基，混匀后，在室温下冷却，待培养基凝固后倒置培养。

由于乙二胺四乙酸二钠有一定的抑菌活性，在较低的稀释倍数下，平皿法不能有效去除抑菌性，因此无法准确检出微生物的污染。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种能够有效地去除供试品抑菌性、能够有效地检出乙二胺四乙酸二钠的微生物污染、确保检验结果准确的一种乙二胺四乙酸二钠微生物限度检查方法。

按照本发明提供的技术方案，所述乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法包括以下步骤：

步骤一、准确称取乙二胺四乙酸二钠，加入0.1％(g/g)～1％(g/g)无菌氯化钙溶液中，在35～45℃下加热10～60分钟，充分混匀至完全溶解，制成所需稀释级的供试液；

步骤二、准确量取适宜稀释级的供试液至无菌过滤器内，过滤器的数量取决于期望获得用于需氧菌总数计数以及霉菌和酵母菌总数计数的样品数量，开启真空泵和阀门进行过滤；过滤完毕，用无抑菌性的淋洗液淋洗滤膜；过滤完毕，关闭阀门和真空泵，打开无菌过滤器的滤缸，用无菌镊子将滤膜菌面朝上贴于TSA培养基与SDA培养基表面，一个培养基平皿内只放入一张滤膜，TSA培养基用于需氧菌总数计数，SDA培养基用于霉菌和酵母菌总数计数；

步骤三、将TSA培养基置于30～35℃、SDA培养基置于20～25℃，均倒置培养3～7天，定时观察菌落生长情况，点计滤膜上生长的所有菌落数，取计数结果最高的菌落数平均值作为最终结果。

作为优选，步骤一中，无菌氯化钙的浓度为0.3％(g/g)。

作为优选，步骤一中，加热温度控制在40～44℃，加热时间控制在45分钟。

作为优选，步骤一中，稀释度控制在1:10。

作为优选，步骤二中，所述淋洗液为pH7.0的无菌NaCl-蛋白胨缓冲液、0.1％(g/g)无菌蛋白胨水溶液或者pH7.2磷酸盐缓冲液。

作为优选，步骤三中，将TSA培养基置于30～35℃下培养5天，将SDA培养基置于20～25℃下培养5天。

本发明在供试液制备中使用了0.1％(g/g)～1％(g/g)的无菌氯化钙溶液，其中的二价钙离子能够与乙二胺四乙酸二钠进行螯合，作为中和剂可去除乙二胺四乙酸二钠的抑菌性。