[发明专利]一株环形灵菌红素产生菌及其色素的纯化制备与应用

权利要求书

1.一株环形灵菌红素产生菌，其特征在于该菌为Zooshikella sp.SZ-14，已于2021年02月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏中心登记入册编号：GDMCC No: 61474。

2.如权利要求1所述环形灵菌红素产生菌纯化制备环形灵菌红素的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将菌株Zooshikella sp.SZ-14接种于Zobell 2216E液体培养基中，摇床避光培养，得种子液；

2)将种子液转接至Zobell 2216E液体培养基中，摇床避光培养，得菌株培养物；所述种子液的接种量为1％～5％；摇床避光培养的条件为28～37℃，100～200rpm，24～48h；

3)将菌株培养物离心取沉淀，加入无水乙醇，振荡避光萃取；将混合物离心取上清萃取液，旋转蒸干，得乙醇粗提物；所述离心的条件为6000～10,000g，10～15min；所述振荡避光萃取是于4℃下振荡避光萃取2～6h；所述旋转蒸干的温度为50～60℃；

4)在乙醇粗提物中加入乙酸乙酯，振荡避光萃取；将混合物离心取上清萃取液，旋转蒸干，得色素粗提物；所述振荡避光萃取是于4℃下振荡避光萃取2～6h；所述离心的条件为6000～10,000g，10～15min；所述旋转蒸干的温度为40～45℃；

5)将色素粗提物溶解于乙酸乙酯中，加入硅胶粉吸附混匀，旋转蒸干，倒出干粉备用；所述色素粗提物、乙酸乙酯、硅胶粉的配比为40～55mg︰4.5～5mL︰1g；所述硅胶粉的细度为200～300目；所述旋转蒸干的温度为40～45℃；

6)硅胶粉用正己烷浸泡、超声除气泡后，引流倒入层析柱；所述硅胶粉的细度为200～300目；所述硅胶粉与正己烷的配比为25g︰50～100mL；所述超声除气泡的时间为10～15min；

7)硅胶柱层析：采用干法上样，将步骤5)中的干粉样品加入层析柱，洗脱至红色物质全部流出，合并收集深红色及棕红色组份A，旋转蒸干；所述洗脱是按以下顺序进行洗脱：(a)正己烷洗脱100～200mL；(b)正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇的体积比为10︰4︰1；所述旋转蒸干的温度为40～45℃；

8)将组份A溶解于甲醇中，利用制备型高效液相色谱仪分离纯化环形灵菌红素；

9)收集液相色谱保留时间为12～15min处的物质，旋转蒸干溶液中的甲醇；剩余水相中加入等体积乙酸乙酯，振荡避光萃取；将混合液离心取上层乙酸乙酯相，再旋转蒸干，用甲醇溶解即得环形灵菌红素。

3.如权利要求2所述环形灵菌红素产生菌纯化制备环形灵菌红素的方法，其特征在于在步骤1)中，所述摇床避光培养的条件为28～37℃，100～200rpm，16～24h。

4.如权利要求2所述环形灵菌红素产生菌纯化制备环形灵菌红素的方法，其特征在于在步骤4)中，所述色素粗提物、乙酸乙酯、硅胶粉的配比为50mg︰5mL︰1g。

5.如权利要求2所述环形灵菌红素产生菌纯化制备环形灵菌红素的方法，其特征在于在步骤8)中，所述制备型高效液相色谱仪分离纯化的条件为：(a)制备柱：Sunfire^TMPrepC18Column，10×100mm，5μm；Waters,Ireland；(b)流动相：55％甲醇溶液，其中，甲醇︰ddH₂O＝55︰45，v/v，0.035％三氟乙酸；(c)流速：5.0mL/min；(d)检测波长：535nm。

6.如权利要求2所述环形灵菌红素产生菌纯化制备环形灵菌红素的方法，其特征在于在步骤9)中，所述旋转蒸干溶液中的甲醇的温度为50～60℃；所述振荡避光萃取的时间为2～6h；所述离心的条件为6000～10,000g，10～15min；所述再旋转蒸干的温度为40～45℃。