[发明专利]一种氨基糖苷类抗生素抗性基因检测引物及试剂盒

说明书

本发明属于试剂盒技术领域，提供一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物及试剂盒，包括引物、qPCR反应试剂、smartchip芯片以及wafergen耗材，所述引物由35对氨基糖苷类抗生素抗性基因和内参16SrRNA基因的特异性引物组成，所述wafergen耗材包括384深孔板、qPCR膜、芯片暂封膜、芯片滤膜和芯片qPCR膜，本试剂盒一次可检测144个环境样本。采用wafergen平台进行ARGs检测，很好的解决了目前qPCR方法通量低的缺点。自行编写的自动化脚本，实现快速绝对拷贝数的计算。将以上36对引物预喷在芯片上，然后组装成试剂盒，方便后续环境测检点的快速检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物及试剂盒。

背景技术

抗生素自被发现以来在临床医学、畜牧养殖以及农业病虫害防治等领域的广泛应用已导致耐药病原菌和抗性基因的传播，其危害受到世界范围的重视。2014年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的报告提出抗生素抗性为21世纪面临的最严峻的人类健康挑战，需要加强全球抗药性的监管。早已有研究提出将抗性基因作为一种新的环境污染物。

氨基糖苷类抗生素是光谱、高效抗生素，具有许多适用于临床治疗感染的特征，尤其适合用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染，再医疗、农业、养殖业等领域有广泛应用。中国40％的抗生素用于畜牧业上，2008年全国重点城市抗生素市场排序资料显示，氨基糖苷类位列第五，仍是临床上使用量最多的五大抗生素之一。中国是氨基糖苷类抗生素的主要生产国，至2010年，中国链霉素产能已超过2800t，其中出口占总产量的58％，庆大霉素产能突破2500t，其他卡那霉素、奈替米星等也合计1000t。氨基糖苷类抗生素脂溶性差，因此人体和畜禽的肠胃道几乎不吸收，肌肉注射后大部分以原药经肾排泄，同时粪肥和抗生素又被用在农业上，并可能转移至土壤及周围人体中，最终进入食物链，对动物和人体健康以及生态系统构成潜在威胁。

细菌对氨基糖苷类抗生素逐渐产生了抗性，耐药菌残留在动物及农作物中，继而危害人类健康。另一方面，抗生素在禽畜养殖中的滥用以及环境中残留诱导微生物产生耐药基因，因此环境中氨基糖苷类抗生素及抗性基因的调查和控制至关重要。有研究认为氨基糖苷类抗性基因(aac(3)、aac(6’)、ant(2”)、aph(2”))是在污水、废水和动物粪便中最频繁检出的一类抗性基因，在天然水体中也有检出。但是目前检测抗性基因最常用的方法是qPCR和宏基因组的方法。其中宏基因组的方法，能检测样本中目前已注释的所有ARG的信息，但是价格昂贵，不适合大范围多样本的检测；传统的qPCR虽然便宜，能进行绝对定量，但是通量小，一次最多只能进行384个qPCR反应；目前用qPCR方法做ARGs检测时，做绝对定量的方法是仅绘制16S rRNA一条标准曲线，然后用相对定量的比值乘以对应的16S rRNA绝对拷贝数，具体公式如下：

相对拷贝数计算公式：

Gene copy number＝10^{(31-CT)/(10/3)}

绝对拷贝数计算公式：

目的基因绝对拷贝数＝16s rRNA绝对拷贝数*(目的基因的相对拷贝数/16srRNA的相对拷贝数)

但是以上公式计算出来的绝对拷贝数其实并不准确。最为准确的方法是每种ARG都构建一个标准品，然后各绘制一个标准曲线。分别计算各自的绝对拷贝数。但是由此会增加另外一个难点，就是随着ARGs的引物数增加时，出现假阳性的概率越来越大，同时计算绝对拷贝数的工作量会越来越大。

发明内容

针对现有技术中qPCR方法通量小、假阳性高、计算绝对拷贝数工作量大等问题，本发明提供了一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物及试剂盒。

一种环境中氨基糖苷类抗生素抗性基因的高通量定量检测引物，包括35对引物对和内参16S rRNA基因序列，其中35对引物对如下：