[发明专利]脊髓性肌萎缩症检测方法

说明书

本发明公开一种脊髓性肌萎缩症检测方法，其中，脊髓性肌萎缩症检测方法包括样本基因组DNA的提取、扩增引物和检测探针的设计及合成、荧光定量PCR反应、基因相对拷贝数的计算及碱基突变水平的分析。本发明脊髓性肌萎缩症检测方法可以实现对SMN1相对拷贝数、SMN2相对拷贝数及SMN1点突变的同时检测，检测全面，步骤简单，易于临床应用和推广。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种脊髓性肌萎缩症检测方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是一种较常见的隐性遗传性疾病。根据SMA患者的发病年龄和临床表现分为4型：I型(严重型)、Ⅱ型(中间型)、Ⅲ型(轻型)和IV型(成人型)。SMA的致病基因SMN位于染色体5qll.2-13.3，存在2个同源性高度一致的拷贝，分别为端粒侧SMN1和着丝粒侧SMN2。SMN基因的终止密码子位于第7号外显子上，SMN1和SMN2的编码序列仅存在一个碱基的差异，即第7外显子内CT的差异。

SMN1缺失是引起SMA的主要原因，约95％患者由SMN1第7外显子的缺失导致，极少部分由SMN1第7外显子缺失的同时伴随碱基的突变或其他变异导致。SMN1缺失大部分为第7外显子合并第8外显子共同缺失，由于SMN的终止密码子位于第7外显子上，第8外显子位于非编码区，所以SMN1的缺失通常指第7外显子的缺失。5％的SMA患者由SMN1基因发生碱基突变导致，其突变位点位于SMN1基因的不同功能区域可引起不同的临床表型。因为SMN2基因可以产生10％～15％具有功能的、结构稳定的SMN全长蛋白，被普遍认为是SMA的修饰基因，SMN2基因的拷贝数与疾病的临床表型和患者的生存时间相关，临床症状较轻的患者的SMN2基因拷贝数通常比症状严重的患者的拷贝数多。

目前，已有多种检测技术对SMA进行检测和诊断，例如一代测序、双侧双重AS-PCR、荧光定量PCR、多重连接探针扩增技术(MLPA)、二代测序、PCR-DHPLC等，但是现有检测方法的检测结果不够全面和准确。

上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种脊髓性肌萎缩症检测方法，旨在解决现有检测方法的检测结果不够全面和准确的技术问题。

为实现上述目的，本发明提出一种脊髓性肌萎缩症检测方法，包括如下步骤：

(1)将包含样本基因组DNA、第一扩增引物组和第一检测探针组的第一反应管放入荧光定量PCR仪中，将包含样本基因组DNA、第二扩增引物组和第二检测探针组的第二反应管放入荧光定量PCR仪中；所述第一反应管和所述第二反应管在荧光定量PCR仪中进行PCR反应；

(2)荧光定量PCR仪检测所述第一反应管和所述第二反应管产生的荧光强度，通过测得的荧光强度值计算所述第一反应管中相应序列的相对拷贝数，及通过得到的熔解曲线分析所述第二反应管中的序列是否发生碱基突变；

其中，所述第一扩增引物组用以分别特异性地扩增SMN1基因第7外显子、SMN2基因第7外显子及内参基因，所述第一检测探针组用以分别特异性地检测SMN1基因、SMN2基因及内参基因分别经由所述第一扩增引物组扩增后的序列；所述第二扩增引物组用以分别特异性地扩增SMN1基因的多个突变位点，所述第二检测探针组用以分别特异性地检测SMN1基因经由所述第二扩增引物组扩增后的序列。

可选地，所述第一扩增引物组包括P1-SMN-EX7-F、P2-SMN-EX7-R、P1及P2；其中，所述P1-SMN-EX7-F的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；所述P2-SMN-EX7-R的核苷酸序列如SEQID No：2所示；所述P1的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；所述P2的核苷酸序列如SEQ IDNo：4所示。