[发明专利]一种促进马尾松丛生芽诱导增殖分化及有效伸长的培养方法

权利要求书

1.一种促进马尾松丛生芽诱导增殖分化及有效伸长的培养方法，包括以下步骤：

S1、外植体预处理：取成熟饱满的马尾松种子，去除种皮作为外植体并在接种前进行消毒灭菌处理；

S2、初代不定芽诱导：将灭菌后的外植体接种于第一培养基中培养，得到的种胚转移到第二培养基中进行继代培养；其中，所述第一培养基为WPM培养基+蔗糖+琼脂+33.3~44.4μmol/L 6-BA，pH5.8；所述第二培养基为WPM培养基+活性炭；

步骤S2中，所述外植体在第一培养基中培养时间为8~16d；

S3、不定芽伸长培养：将经步骤S2培养后的外植体进行不定芽伸长培养；

步骤S3中，进行不定芽伸长培养具体方法为：先将经步骤S2培养后的外植体转接至第六培养基中培养16~30天，然后接种至第七培养基中培养16~30天，所述第六培养基和第七培养基均为WPM培养基；

S4、继代腋芽增殖培养：将经步骤S3伸长培养后的外植体切割为单个不定芽或1.5~2.0cm的茎段作为腋芽增殖外植体，将所述增殖外植体接种至第三培养基中进行茎段继代腋芽增殖培养；其中，所述第三培养基为WPM培养基+4.44~22.2μmol/L 6-BA；

S5、茎段腋芽伸长培养：将经步骤S4增殖培养后的外植体接种至第四培养基中进行茎段腋芽伸长培养；所述第四培养基为改良WPM培养基0.78~0.98μmol/L IBA+0.33~0.44μmol/L 6-BA，所述改良WPM培养基中铵硝比为0.2~0.4；

S6、伸长腋芽生根诱导：将经步骤S5培养后的外植体转接至第五培养基中进行生根诱导培养；所述第五培养基为1/2WPM培养基+9.8~19.6μmol/L IBA；

其中，上述的培养过程中，培养条件为：培养温度23±2℃，光照强度2000~3000lx，光暗周期16h/8h。

2.根据权利要求1所述的促进马尾松丛生芽诱导增殖分化及有效伸长的方法，其特征在于，第五培养基中，IBA浓度为16.8~19.6μmol/L。

3.根据权利要求1所述的促进马尾松丛生诱导增殖分化及有效伸长的培养方法，其特征在于，步骤S1中，消毒处理具体为：所述马尾松种子先用自来水快速清洗，沥干水分，用镊子去除内外种皮，接着用0.5%K₂MnO₄溶液浸泡，然后清洗去除K₂MnO₄残留液。

4.根据权利要求3所述的促进马尾松丛生诱导增殖分化及有效伸长的培养方法，其特征在于，步骤S1中，灭菌处理为：经消毒后的马尾松种子先用75%的酒精处理，无菌水清洗，再用0.1%升汞处理，再用无菌水清洗。

5.根据权利要求1所述的促进马尾松丛生芽诱导增殖分化及有效伸长的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、外植体预处理：选取饱满、完整的马尾松成熟种子，用自来水冲洗，沥干水分，用镊子去除内外种皮；然后用0.5%K₂MnO₄溶液浸泡搅拌30min，无菌水清洗2-3次以去除K₂MnO₄；接着用75%的酒精处理30s，无菌水清洗，再用0.1%升汞处理5~6min，最后用无菌水冲洗；

S2、初代不定芽诱导：将灭菌后的外植体接种于第一培养基中培养16~32天，得到的种胚转移到第二培养基中进行继代培养；其中，第一培养基为WPM培养基+30.0g/L蔗糖+8.5g/L琼脂+33.3-44.4μmol/L 6-BA，pH5.8；第二培养基为WPM培养基+3g/L活性炭；所述WPM培养基先经121℃高温灭菌20min，冷却凝固后使用；

S3、不定芽伸长培养：将经步骤S2培养后的外植体转接至WPM初代培养基中培养28天，再接种至WPM继代培养基中进行继代培养，继代周期为28天；

S4、继代腋芽增殖培养：将经步骤S3伸长培养后的外植体切割为单个不定芽或1.5~2.0cm的茎段作为腋芽增殖外植体，将所述腋芽增殖外植体接种至第三培养基中进行茎段继代腋芽增殖培养16~32d；其中， 第三培养基为WPM培养基+22.2μmol/L 6-BA；

S5、茎段腋芽伸长培养：将经步骤S4增殖培养后的外植体接种至第四培养基中进行茎段腋芽伸长培养16~32天，所述第四培养基为改良WPM培养基+0.98μmol/L IBA+0.44μmol/L6-BA，所述改良WPM培养基中铵硝比为0.2~0.4；

S6、伸长腋芽生根诱导：将经步骤S5培养后的外植体转接至第五培养基中进行生根诱导培养16~32天；所述第五培养基为1/2WPM培养基+9.8μmol/L IBA；

其中，上述培养过程中，培养条件为：培养温度23±2℃，光照强度2000-3000lx，光暗周期16h/8h。