[发明专利]LPD纳米脂质体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种LPD纳米脂质体，该LPD纳米脂质体包含：DOTAP、胆固醇、鱼精蛋白、小牛胸腺DNA、RNA核酸药物、PEG，所述DOTAP和胆固醇形成DOTAP/Chol纳米脂质体，在该DOTAP/Chol纳米脂质体里面包载有小牛胸腺DNA、RNA核酸药物和鱼精蛋白的聚合物，所述DOTAP/Chol纳米脂质体外表面连接有PEG。本发明的LPD纳米脂质体，具有很好的RNA包载能力，尤其是包载大片段RNA，可有效的在体外将大片段目的基因导入到细胞内，在体内可以保护和稳定表达RNA，使其产生相应的功能，具有转染效率高，细胞毒性低的优点，且包载肿瘤RNA的LPD纳米脂质体注入到机体后，可引起相关抗肿瘤免疫反应，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种LPD(liposome-polycation-DNA，脂质体-多聚阳离子-DNA复合物)纳米脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

核酸基因导入在基因功能研究和核酸治疗中有重要的应用，同时基因治疗是目前治疗遗传性疾病或后天获得性疾病比较理想的治疗手段。递送载体主要分为两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然在基因转移方面具有一定的优点，但其体内应用具有较大的潜在危险，限制了它在临床基因治疗上的应用。阳离子脂质体是目前应用较为广泛的递送RNA核酸的一种非病毒载体，它具有无毒、可自然降解、无免疫原性、可以大量合成并放大生产等优点，近年来备受研究者的重视，至今已有数十种阳离子脂质体被研制合成。

DOTAP，化学名称为(1,2-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵，分子式C₄₂H₈₀NO₄Cl，是一种带正电荷的两亲性类脂化合物，属于阳离子脂质体，并且是研究使用最多的阳离子脂质体，具有很高的安全性和功能性。作为非病毒载体，DOTAP与病毒载体相比有很多优势：(1)保护治疗基因在体内循环中不被降解。(2)高效穿过细胞膜和核膜，转染细胞，使其表达/沉默基因。(3)能够选择性的吸附于带负电荷的新生肿瘤血管内皮细胞上，抗癌效果更好等。但是，单独使用DOTAP形成的脂质体稳定性、膜融合性、转染效率差，需要一些辅助脂质的物质。

脂质体是携有双层包膜的脂质小囊。作为非病毒载体可以通过内吞作用向细胞内传递蛋白质、多肽和DNA、RNA，在肿瘤的生物治疗方面有着广泛的应用。在RNA疫苗中，因为RNA稳定性较DNA差，易被RNA酶降解。故在RNA转染肿瘤细胞时常用脂质体包裹RNA后再进行转染，可起到保护RNA的作用，但脂质体对细胞存在一定的毒性，同时要起效需要一定量的RNA。

化疗药物对肿瘤治疗有一定的有效率，因此化疗药物一般都联用手术治疗或其他靶向治疗、放疗等来提高肿瘤治疗有效率，但是化疗药物也给身体带来了很大的副作用。

发明内容

本发明要解决目前缺乏高效低毒载药量高的递送核酸药物载体的技术问题，提供一种LPD纳米脂质体，该脂质体通过改变LPD结合方式和配方，在减少DOTAP阳离子脂质体使用量下增加LPD对RNA核酸的包载量，显著提高其RNA核酸载药量，且稳定性高、毒性低。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种LPD纳米脂质体，其包含：DOTAP、胆固醇、鱼精蛋白、小牛胸腺DNA、RNA核酸药物、PEG，所述DOTAP和胆固醇形成DOTAP/Chol纳米脂质体，在该DOTAP/Chol纳米脂质体里面包载有小牛胸腺DNA、RNA核酸药物和鱼精蛋白的聚合物，所述DOTAP/Chol纳米脂质体外表面连接有PEG。

优选的，所述LPD纳米脂质体的粒径为115～125nm。

优选的，所述LPD纳米脂质体对RNA核酸药物的包封率为9.07％(136.86ug/ml)。更优选的，所述LPD纳米脂质体的PEG含量约为4.01％，磷脂比为0.639mg/ml，用较少的磷脂合理有效地包封了RNA核酸药物。